Urządzenie mikroprzepływowe do odtwarzania mikrośrodowiska guza in vitro

Summary

Przedstawiamy procedurę wytwarzania i działania urządzenia mikroprzepływowego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska guza in vitro. Zmienność apoptozy w tkance nowotworowej określono ilościowo za pomocą barwienia fluorescencyjnego i oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego doksorubicyny do tkanki nowotworowej.

Abstract

Opracowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe, które naśladuje dostarczanie i systemowe usuwanie leków do heterogenicznych trójwymiarowych tkanek nowotworowych in vitro. Składniki odżywcze dostarczane przez układ naczyniowy nie docierają do wszystkich części guza, powodując powstawanie niejednorodnych mikrośrodowisk składających się z komórek żywotnych, spoczynkowych i martwiczych. Wiele leków przeciwnowotworowych nie jest w stanie skutecznie przenikać i leczyć wszystkich typów komórek z powodu tej niejednorodności. Monowarstwy komórek nowotworowych nie naśladują tej niejednorodności, co utrudnia testowanie leków przeciwnowotworowych za pomocą odpowiedniego modelu in vitro. Nasze urządzenia mikroprzepływowe zostały wyprodukowane z PDMS przy użyciu miękkiej litografii. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe, utworzone metodą zwisającej kropli, zostały wprowadzone i zamknięte w prostokątnych komorach na urządzeniu i utrzymywane z ciągłą perfuzją pożywki po jednej stronie. Prostokątny kształt komór w urządzeniu tworzył liniowe gradienty w tkance. Barwienia fluorescencyjne wykorzystano do ilościowego określenia zmienności apoptozy w tkance. Guzy na urządzeniu leczono fluorescencyjnym lekiem chemioterapeutycznym doksorubicyną, zastosowano mikroskopię poklatkową do monitorowania jej dyfuzji do tkanki i oszacowano efektywny współczynnik dyfuzji. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie uformowanie jednolitych sferoid z kilku linii komórek nowotworowych. Urządzenie umożliwiało wzrost sferoid przez okres do 3 dni. Komórki znajdujące się w pobliżu przepływającego podłoża były minimalnie apoptotyczne, a te znajdujące się daleko od kanału były bardziej apoptotyczne, dzięki czemu dokładnie naśladowały regiony w guzach przylegających do naczyń krwionośnych. Szacowana wartość współczynnika dyfuzji doksorubicyny zgadzała się z wcześniej podawaną wartością w ludzkim raku piersi. Ponieważ przenikanie i zatrzymywanie leków w guzach litych wpływa na ich skuteczność, uważamy, że to urządzenie jest ważnym narzędziem w zrozumieniu zachowania leków i opracowywaniu nowych terapii przeciwnowotworowych.

Protocol

1. Produkcja urządzeń

Replikacja cech mikroprzepływowych w materiałach elastomerowych była oparta na metodzie opisanej przez Duffy et ^al.1

1. Mieszanka elastomerów (polidimetylosiloksan; PDMS) i utwardzacza z zestawu elastomerów silikonowych (Dow Corning, Midland, MI) w stosunku wagowym 9:1 i zalać masterem, tworząc warstwę o grubości 4 mm. Odgazować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i utwardzić mieszaninę w temperaturze 60°C przez 5 godzin. Oderwij utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać stempel cech płynięcia na elastomerze.
2. Dziurkowanie otworów na wloty i wyloty za pomocą stempla do biopsji 1,5 mm (Miltex, York, PA) zamontowanego na wiertarce. Wyciągnij wszelkie zanieczyszczenia.
3. Poddaj stronę cech stempla i czysty szkiełko plazmie tlenowej przez 8 minut w wytrawiaczu plazmy tlenowej. Natychmiast zetknąć obrabiane powierzchnie, aby utworzyć między nimi wiązanie. Utrzymuj zespół w temperaturze 60°C na podgrzewaczu do szkiełka przez co najmniej 5 godzin, aby wzmocnić wiązanie.
4. Podłącz rurkę PTFE 0,032" ID (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) do wlotów i wylotów za pomocą interfejsu męskich złączy luer lock dołączonych do kolczastych żeńskich złączy luer lock (Qosina, Edgewood, NY).
5. Skonfiguruj zestaw przepływu za pomocą zaworów odcinających i łącznika Y (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Rysunek 1). Zamontuj urządzenie na mikroskopie. Podłączyć strzykawki do rurki za pomocą igieł 20G 1,5" (BD Bioscience, Rockville, MD).

2. Tworzenie jednolitych sferoid

Sferoidy zostały utworzone metodą wiszącego spadku^2,3.

1. Trypsynizuj komórki pod sterylnym kapturem do hodowli komórek.
2. Odwirować trypsynizowane komórki z prędkością 2000 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić w 6 ml świeżej pożywki. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do pożądanego stężenia końcowego (tabela 1).
3. Zdejmij pokrywę płytki 48-dołkowej i umieść ją do góry nogami w wysterylizowanym kapturze. Na pokrywie widoczne są okrągłe obszary odpowiadające każdej studzience. Napełnij każdą studzienkę płytki 1 ml wysterylizowanej wody, aby utrzymać wilgotność. Umieścić 20 μl kropli rozcieńczonego roztworu komórkowego w każdym okrągłym obszarze za pomocą mikropipety. Ostrożnie odwróć pokrywę i umieść ją na płycie studzienki, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi studzienek.
4. Inkubować płytkę studzienki w temperaturze 37°C przez określoną liczbę dni (tabela 1). W każdej wiszącej kropli utworzy się sferoida.

3. Wprowadzenie sferoid do urządzenia

Patrz Rysunek 1 i Tabela 2 dla tej sekcji.

1. Wysterylizuj urządzenie, przepłukując 70% etanolem wprowadzanym przez wlot przepływu. Następnie przepłukać PBS, a następnie pożywką do hodowli komórkowych buforowaną HEPES. Pozostawić środkową strzykawkę S_F podłączoną do rurki.
2. Narysuj 2-3 sferoidy do strzykawki S_P, postukaj w strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza i przymocuj do wlotu uszczelnienia urządzenia.
3. Otwórz zawór wlotowy V_Pin i zamknij_{V Fin}. Otwórz zawór wylotowy V_Pout i zamknij V_Fout. Trzymać strzykawkę do pakowania pionowo z igłą skierowaną w dół; Obserwuj, jak sferoidy osiadają na dnie strzykawki w złączu Luer Lock igły. Wciśnij tłok na strzykawkę do pakowania i obserwuj, jak sferoidy wchodzą do rurki i wpływają do urządzenia. Ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy uszczelnienia, sferoida wejdzie do komory urządzenia i zostanie utrzymana przez słupki z tyłu (rys. 2).
4. Zamknij zawór wlotowy V_Pin i zawór wylotowy V_Pout. Zamontować strzykawkę S_F na pompie strzykawkowej. Otwórz zawór V_Fin i zawór V_Fout. Przepływ medium do urządzenia z prędkością 3 μl/min.

4. Wprowadzenie Agenta Wykrywającego Apoptozę (CaspGLOW)

Po zapełnieniu komór sferoidami, pozwól na równowagę przez maksymalnie 24 godziny, aby ustalić gradienty składników odżywczych i mikrośrodowiska, zanim wprowadzisz środki wykrywające apoptozę lub terapeutyczne. Ponieważ tkanki w komorach stykają się z nieprzenikalnymi ścianami od góry i od dołu, nie ma gradientów składników odżywczych wzdłuż grubości (0,15 mm) tkanki. Po 24 godzinach inkubacji wszystkie warstwy komórek wzdłuż grubości tkanki są zatem równe, a jedyna niejednorodność występuje w kierunku przeciwnym do kanału przepływowego.

1. Odciąć V_Fin, zatrzymać pompę strzykawkową, wyjąć strzykawkę S_F z pompy i zastąpić ją strzykawką zawierającą 0,25 μl/ml markera CaspGLOW Red Active Caspase-3 (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, Kalifornia).
2. Ręcznie przepłukać 0,7 ml tego roztworu przez urządzenie, aby zapewnić przemieszczenie starszego podłoża. Zamontuj strzykawkę na pompie, uruchom ponownie przepływ i otwórz_{V Fin}. W ciągu 5-8 godzin środek wykrywający apoptozę dyfunduje do tkanki i jaśniej fluoryzuje w obszarach apoptozy. Czynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych do urządzenia.

Uwaga:

1. Niejednorodność tkanek można potwierdzić, uzyskując liniowe profile intensywności fluorescencji opisane w punkcie 6. Profile powinny wykazywać gradienty przestrzenne apoptozy, potwierdzające, że tkanka jest niejednorodna pod względem żywotności komórek.
2. CaspGLOW Zielony marker aktywnej kaspazy-3 (Fluoresceina-DEVD-FMK; Biovision) może być również stosowany do wykrywania apoptozy. Marker ten zawiera zielony fluorofor fluoresceinę zamiast czerwonego fluoroforu rodaminy.

5. Wprowadzenie środka terapeutycznego

1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1-4.2, aby wprowadzić 10 μM chlorowodorek doksorubicyny (Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zawierający środek wykrywający apoptozę.
2. Kontynuuj przepływ roztworu środka terapeutycznego przez określony czas. Zamknąć zawór V_Fin i wyłączyć pompę strzykawkową. Zastrzykawkę z lekiem należy zastąpić strzykawką ze świeżym podłożem zawierającą środek wykrywający apoptozę. Pozwól na przepływ świeżej pożywki przez 24 –36 godzin, stale monitorując tkankę pod mikroskopem.

6. Mikroskopia poklatkowa i szacowanie współczynników dyfuzyjności leków

Aby uzyskać najczystsze dane o fluorescencji, uzyskaj wszystkie obrazy, skupiając mikroskop na dolnych warstwach tkanek. Ponieważ nie ma gradientów składników odżywczych w kierunku pionowym (patrz sekcja 4), dolne warstwy komórek są dobrymi przedstawicielami wszystkich innych warstw powyżej.

1. Cały proces akwizycji został zautomatyzowany za pomocą dostosowanego skryptu w IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Pozyskiwanie światła przechodzącego oraz obrazy fluorescencyjne upakowanej sferoidy w 10-krotnym powiększeniu co 30 minut (ryc. 3A). Uzyskiwanie obrazu tła fluorescencji przed wprowadzeniem Dox. Aby dostosować się do dużego rozmiaru komory (1000 μm x 300 μm), zaopatrz się w dwa przylegające do siebie obrazy i kafelkować je razem⁴.
2. W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leków, pierwszym krokiem jest wygenerowanie uśrednionych liniowych profili intensywności fluorescencji Dox przy użyciu ImageJ. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) obejmujący tkankę w komorze. Polecenie Profil działki służy do generowania profilu średnich intensywności w funkcji odległości od kanału przepływu. Powtórz tę czynność dla maksymalnie 3 różnych punktów czasowych.
3. Uzyskaj obraz fluorescencji tła przed wprowadzeniem Dox w celu zmierzenia autofluorescencji z tkanki. Odejmij średnią intensywność fluorescencji tła od uzyskanych profili intensywności i znormalizuj każdy profil o odpowiednią maksymalną intensywność, aby uzyskać (x,t)(rys. 3B).
4. Następnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji D Dox w tkance nowotworowej. Dyfuzję Dox można przedstawić za pomocą następującego równania⁵
   
   gdzie erfc jest funkcją błędu komplementarnego, x jest odległością w tkance od kanału, a t jest czasem po wprowadzeniu Dox (patrz rys. 3). Użyj następującego schematu iteracyjnego w każdym rozważanym punkcie czasowym:
   • Odgadnij wartość dla D
   • Oblicz prawą stronę równania w każdym położeniu x
   • Obliczać sumę błędów kwadratowych (reszt) między dwiema stronami
   • Zmodyfikuj D, aby zminimalizować pozostałość
5. Uśrednić optymalne wartości D uzyskane w każdym punkcie czasowym, aby oszacować średni efektywny współczynnik dyfuzji Dox w tkance.

7. Reprezentatywne wyniki:

Urządzenia mikroprzepływowe dostarczyły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1mm x 0,3mm x 0,15mm do wzrostu trójwymiarowa tkanka nowotworowa. Wielokomórkowe sferoidy guza zostały wpuszczone do tych komór i zostały zatrzymane przez dwa słupki filtracyjne w z tyłu. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie formowanie sferoid o stałej wielkości i kształcie z kilku linii komórkowych. Sferoidy były z powodzeniem uprawiane na urządzeniu przez okres do 3 dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrośrodowiska w sferoidach. Apoptoza występowała rzadziej w komórkach w pobliżu kanału przepływowego i wyżej w głąb tkanki. Urządzenie posłużyło do oszacowania współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance nowotworowej. Uzyskana wartość 8,75 x ^10-7 cm^{2 s-1} zgadza się o wartości 9,1 x ^10-7 cm^{2 S-1} zgłaszane wcześniej⁶ w ludzkim raku piersi.

Linia komórkowa Wymagane stężenie komórek Czas inkubacji Zobacz materiał LS174T 300 komórek/μL 2-3 dni T47D 750 komórek/μL 3-4 dni MDA-MB-231 150 komórek/μL 5-6 dni

Tabela 1. Parametry dla wiszących sferoid opadających

część opis S_F Strzykawka przepływowa S_P Strzykawka do pakowania V_Płetwa Zawór wlotowy przepływu _Szpilka V Zawór wlotowy uszczelnienia V_Fout Zawór wylotowy przepływu V_{Pout (Dziąsek V)} Zawór wylotowy uszczelnienia

Tabela 2. Strzykawki i zawory w konfiguracji przepływu

Rysunek 1. Schemat konfiguracji przepływu V_Fin i V_Fout: Wlot i wylot przepływu Zawory; V_Pin i_{V Pout}: Zawory wlotowe i wylotowe uszczelnienia; S_F i S_P: Strzykawki przepływowe i do pakowania. Ten Strzykawka do pakowania oraz zawory wlotowe i wylotowe uszczelnienia są używane, gdy sferoida jest wlatywana do komory. Strzykawka przepływowa i wlot przepływu i zawory wylotowe służą do późniejszego przepływu medium.

Rysunek 2. Schemat sferoidy uwięzionej w komorze na urządzeniu. Sferoida jest przepływana do komory na urządzeniu i jest blokowana przez dwa słupki filtracyjne z tyłu komory.

Rysunek 3. Dyfuzja doksorubicyny w tkance nowotworowej na urządzeniu. ZA. Połączony obraz tkanki w świetle przechodzącym i czerwonej fluorescencji, pokazujący lokalizację i stężenie doksorubicyny (na czerwono). Podziałka skali reprezentuje 250 μm. B. Znormalizowany liniowy profil intensywności z fluorescencji doksorubicyny.

Discussion

Unaczynienie w nowotworach jest rzadkie i słabo rozwinięte^7,8. Istnieją regiony położone daleko (>100 μm) od naczynia krwionośne, które są niedostępne dla składników odżywczych i leków dostarczanych przez naczynia krwionośne⁹. Powstałe w ten sposób niejednorodne mikrośrodowisko przyczynia się do ograniczonej skuteczności wielu chemioterapeutyków¹⁰. Opracowane tutaj urządzenie mikroprzepływowe odtwarza heterogeniczne mikrośrodowisko guza charakteryzujące się proliferującymi, spoczynkowymi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw elastomerów	silikonowych Ellsworth Adhesives	184 Zestaw Sil Elast Dziurkacz
do biopsji Miltex	MedexSupply	MTX-33-31AA	1,5 mm
	Cole-Parmer	EW-06417-31	0,032"
ID Męskie złącze luer lock	Qosina	65111
Złącze żeńskie z zadziorem Luer lock	Qosina	11556
Zawór odcinający	Idex Health and Science	P-721
Łącznik Y	Idex Health and Science	P-513
20G 1,5" igły	BD Biosciences	305176
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
CaspGLOW Fluorescein	Biovision Inc.	K183-25
CaspGLOW Czerwona	Biowizja Inc.	K193-25
Chlorowodorek doksorubicyny	Sigma-Aldrich	44583
LS174T	ATCC	CCL-188	Linia komórkowa ludzkiego raka jelita grubego
T47D	ATCC	HTB-133	Ludzka linia komórkowa raka przewodowego
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	Ludzka linia komórkowa gruczolakoraka sutka