Przedstawiamy procedurę wykonania i obsługi urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza heterogeniczne mikrośrodowiska nowotworowe in vitro. Zmienność apoptozy w obrębie tkanki nowotworowej została określona ilościowo przy użyciu barwników fluorescencyjnych, a następnie oceniono efektywny współczynnik dyfuzji leku chemioterapeutycznego, doksorubicyny, do tkanki nowotworowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opracowaliśmy urządzenie mikrofluidyczne, które naśladuje dostarczanie i systemowe usuwanie leków z heterogenicznych trójwymiarowych tkanek nowotworowych in vitro. Składniki odżywcze dostarczane przez naczynia krwionośne nie docierają do wszystkich części guzów, co prowadzi do powstania heterogenicznych mikrośrodowisk składających się z komórek żywotnych, spoczynkowych i nekrotycznych. Wiele leków przeciwnowotworowych nie przenika skutecznie i nie leczy wszystkich typów komórek właśnie ze względu na tę heterogeniczność. Monowarstwy komórek nowotworowych nie oddają tej heterogeniczności, co utrudnia testowanie leków przeciwnowotworowych przy użyciu odpowiedniego modelu in vitro. Nasze urządzenia mikrofluidyczne zostały wykonane z PDMS metodą miękkiej litografii. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe, utworzone metodą wiszącej kropli, zostały umieszczone i unieruchomione w prostokątnych komorach urządzenia i utrzymywane przy ciągłej perfuzji medium z jednej strony. Prostokątny kształt komór w urządzeniu wytworzył liniowe gradienty w obrębie tkanki. Barwniki fluorescencyjne wykorzystano do ilościowego określenia zmienności apoptozy w tkance. Guzy w urządzeniu leczono fluorescencyjnym lekiem chemioterapeutycznym doksorubicyną, a do monitorowania jego dyfuzji do tkanki wykorzystano mikroskopię poklatkową, co pozwoliło na oszacowanie efektywnego współczynnika dyfuzji. Metoda wiszącej kropli umożliwiła szybkie tworzenie jednorodnych sferoidów z kilku linii komórek nowotworowych. Urządzenie umożliwiło wzrost sferoidów do 3 dni. Komórki znajdujące się w pobliżu płynącego medium wykazywały minimalną apoptozę, natomiast komórki oddalone od kanału były w większym stopniu apoptotyczne, co precyzyjnie naśladowało obszary w guzach sąsiadujące z naczyniami krwionośnymi. Oszacowana wartość współczynnika dyfuzji doksorubicyny była zgodna z wcześniej raportowaną wartością dla raka piersi u ludzi. Ponieważ penetracja i retencja leków w guzach litych wpływają na ich skuteczność, uważamy, że urządzenie to jest ważnym narzędziem w rozumieniu zachowania leków oraz w opracowywaniu nowych terapii przeciwnowotworowych.
Protokół
1. Wytwarzanie urządzenia
Replikacja elementów mikroprzepływowych w materiałach elastomerowych została przeprowadzona w oparciu o metodę opisaną przez Duffy i wsp.1
- Wymieszać elastomer (polidimetylosiloksan; PDMS) oraz czynnik sieciujący z zestawu Silicone Elastomer Kit (Dow Corning, Midland, MI) w stosunku wagowym 9:1 i wylać na matrycę, tworząc warstwę o grubości 4 mm. Odgazować w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie utwardzać mieszaninę w temperaturze 60°C przez 5 godzin. Oddzielić utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać stempel z naniesionymi strukturami przepływowymi na elastomerze.
- Wyciąć otwory wlotowe i wylotowe za pomocą wycinaka do biopsji o średnicy 1.5 mm (Miltex, York, PA) zamontowanego na wiertarce stołowej. Usunąć wszelkie pozostałości materiału.
- Poddać stronę ze strukturami stempla oraz czyste szkiełko przedmiotowe działaniu plazmy tlenowej przez 8 minut w trawaczu plazmowym. Bezzwłocznie zetknąć ze sobą potraktowane powierzchnie, aby utworzyć między nimi wiązanie. Przechowywać zmontowany układ w temperaturze 60°C na podgrzewaczu do szkiełek przez co najmniej 5 godzin w celu wzmocnienia wiązania.
- Podłączyć rurki PTFE o średnicy wewnętrznej (ID) 0.032" (Cole Parmer, Vernon Hills, IL) do wlotów i wylotów, korzystając z interfejsu złożonego z męskich złączy luer lock przymocowanych do żeńskich złączy luer lock z kolcami (Qosina, Edgewood, NY).
- Przygotować układ przepływowy, wykorzystując zawory odcinające i łącznik w kształcie litery Y (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA; Rysunek 1). Zamontować urządzenie na mikroskopie. Podłączyć strzykawki do rurek za pomocą igieł 20G 1.5" (BD Bioscience, Rockville, MD).
2. Formowanie jednorodnych sferoidów
Sferoidy utworzono metodą wiszącej kropli2,3.
- Przeprowadź trypsynizację komórek pod sterylnym dygestorium do hodowli komórkowych.
- Odwiruj trypsynizowane komórki przy 2000 rpm przez 5 minut i resuspenduj w 6 ml świeżej pożywki. Rozcieńcz roztwór zapasowy do pożądanego stężenia końcowego (Tabela 1).
- Zdejmij pokrywkę płytki 48-dołkowej i umieść ją odwróconą do góry dnem w sterylnym dygestorium. Na pokrywce widoczne są obszary koliste odpowiadające każdemu dołkowi. Napełnij każdy dołek płytki 1 ml sterylnej wody w celu utrzymania wilgotności. Za pomocą mikropipety nanieś 20 μl kropli rozcieńczonego roztworu komórek w każdym obszarze kolistym. Ostrożnie odwróć pokrywkę i nałóż ją na płytkę z dołkami, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi dołków.
- Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez określoną liczbę dni (Tabela 1). W każdej wiszącej kropli uformuje się sferoid.
3. Wprowadzenie sferoidów do urządzenia
W tej sekcji należy odnieść się do rysunku 1 i tabeli 2.
- Sterylizujemy urządzenie, przepłukując je 70% ethanolem wprowadzonym przez wlot przepływu. Następnie przepłukujemy PBS, a potem pożywką do hodowli komórkowej buforowaną HEPES. Pozostawiamy strzykawkę z pożywką SF podłączoną do rurek.
- Pobieramy 2-3 sferoidy do strzykawki SP, opukujemy strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i podłączamy ją do wlotu pakującego urządzenia.
- Otwieramy zawór wlotowy VPin i zamykamy VFin. Otwieramy zawór wylotowy VPout i zamykamy VFout. Trzymamy strzykawkę pakującą pionowo z igłą skierowaną w dół; obserwujemy, aż sferoidy opadną na dno strzykawki do złącza luer-lock igły. Naciskamy tłok strzykawki pakującej i obserwujemy, jak sferoidy wpływają do rurek i przedostają się do urządzenia. Ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy pakowania, sferoid wpłynie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu (Rys. 2).
- Zamykamy zawór wlotowy VPin i zawór wylotowy VPout. Montujemy strzykawkę SF w pompie strzykawkowej. Otwieramy zawór VFin oraz zawór VFout. Wprowadzamy pożywkę do urządzenia z przepływem 3 μl/min.
4. Wprowadzenie czynnika wykrywającego apoptozę (CaspGLOW)
Po wypełnieniu komór sferoidami, należy pozostawić je na okres do 24 godzin w celu równowagi, aby ustanowić gradienty składników odżywczych i mikrośrodowiska przed wprowadzeniem czynników terapeutycznych lub wykrywających apoptozę. Ponieważ tkanki w komorach stykają się z nieprzepuszczalnymi ściankami od góry i od dołu, wzdłuż grubości tkanki (0.15mm) nie występują gradienty składników odżywczych. Po 24 godzinach inkubacji wszystkie warstwy komórek wzdłuż grubości tkanki są zatem równoważne, a jedyna heterogeniczność występuje w kierunku oddalenia od kanału przepływowego.
- Zamknij zawór VFin, zatrzymaj pompę strzykawkową, wyjmij strzykawkę SF z pompy i zastąp ją strzykawką zawierającą medium z markerem aktywnej kaspazy-3 CaspGLOW Red w stężeniu 0.25 μl/ml (Red-DEVD-FMK; Biovision, Mountain View, CA).
- Ręcznie przepłucz urządzenie 0,7 ml tego roztworu, aby zapewnić usunięcie starego medium. Zamontuj strzykawkę na pompie, wznowij przepływ i otwórz VFin. W ciągu 5–8 godzin czynnik wykrywający apoptozę dyfunduje do tkanki i fluorescencyjnie rozjaśnia regiony apoptotyczne. Czynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych wprowadzanych do urządzenia.
Uwaga:
- Heterogenność tkanki można potwierdzić, uzyskując liniowe profile intensywności fluorescencji, zgodnie z opisem w sekcji 6. Profile powinny wykazywać gradienty przestrzenne apoptozy, co potwierdza, że tkanka jest heterogenna pod kątem żywotności komórek.
- Do wykrywania apoptozy można również zastosować marker CaspGLOW Green Active Caspase-3 (Fluorescein-DEVD-FMK; Biovision). Marker ten zawiera zielony fluorofor fluoresceinę zamiast czerwonego fluoroforu rodaminy.
5. Wprowadzenie czynnika terapeutycznego
- Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach 4.1-4.2, aby wprowadzić 10 μM chlorowodorku doksorubicyny (Dox; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zawierającego czynnik wykrywający apoptozę.
- Kontynuuj przepływ roztworu czynnika terapeutycznego przez określony czas. Zamknij zawór VFin i wyłącz pompę strzykawkową. Zastąp strzykawkę z lekiem strzykawką z nowym medium zawierającym czynnik wykrywający apoptozę. Pozostaw przepływ nowego medium przez 24–36 godzin, stale monitorując tkankę pod mikroskopem.
6. Mikroskopia time-lapse i szacowanie współczynników dyfuzji leków
Aby uzyskać najczystsze dane fluorescencyjne, należy wykonywać wszystkie obrazy, ustawiając ostrość mikroskopu na dolnych warstwach tkanek. Ze względu na brak gradientów składników odżywczych w kierunku pionowym (patrz Sekcja 4), dolne warstwy komórek są reprezentatywne dla wszystkich pozostałych warstw znajdujących się powyżej.
- Cały proces akwizycji został zautomatyzowany przy użyciu spersonalizowanego skryptu w programie IPLab (BD Bioscience, Rockville, MD). Należy pozyskać obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne upakowanego sferoidu przy powiększeniu 10x co 30 minut (Rys. 3A). Przed wprowadzeniem Dox należy pozyskać obraz fluorescencji tła. Aby uwzględnić duży rozmiar komory (1000 μm x 300 μm), należy pozyskać dwa sąsiadujące obrazy i połączyć je w mozaikę4.
- W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leku, pierwszym krokiem jest wygenerowanie uśrednionych liniowych profili intensywności fluorescencji Dox za pomocą programu ImageJ. Należy zaznaczyć prostokątny obszar zainteresowania (ROI) obejmujący tkankę w komorze. Należy użyć polecenia Plot Profile, aby wygenerować profil średnich intensywności jako funkcji odległości od kanału przepływowego. Czynność tę należy powtórzyć dla maksymalnie 3 różnych punktów czasowych.
- Przed wprowadzeniem Dox należy pozyskać obraz fluorescencji tła, aby zmierzyć autofluorescencję tkanki. Od uzyskanych profili intensywności należy odjąć średnią intensywność fluorescencji tła, a następnie znormalizować każdy profil przez odpowiadającą mu intensywność maksymalną, aby uzyskać
(x,t)(Rys. 3B). - Kolejnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji D dla Dox w tkance nowotworowej. Dyfuzję Dox można przedstawić za pomocą następującego równania5
gdzie erfc to dopełniająca funkcja błędu, x to odległość w głąb tkanki od kanału, a t to czas po wprowadzeniu Dox (patrz Rys. 3). W każdym rozważanym punkcie czasowym należy zastosować następujący schemat iteracyjny:- Przyjąć wartość szacunkową dla D
- Obliczyć prawą stronę równania dla każdego położenia x
- Obliczyć sumę kwadratów błędów (residuum) między obiema stronami
- Zmodyfikować D, aby zminimalizować residuum
- Należy wyciągnąć średnią z optymalnych wartości D uzyskanych w każdym punkcie czasowym, aby oszacować średni efektywny współczynnik dyfuzji Dox w tkance.
7. Reprezentatywne wyniki:
Zastosowane urządzenia mikroprzepływowe zapewniły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1mm x 0.3mm x 0.15mm do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe zostały wprowadzone do tych komór i zatrzymane przez dwa filtry w postaci słupków z tyłu. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie formowanie sferoidów o spójnym rozmiarze i kształcie z kilku linii komórkowych. Sferoidy pomyślnie hodowano w urządzeniu przez maksymalnie 3 dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrootoczenia wewnątrz sferoidów. Apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w pobliżu kanału przepływowego, a częściej głębiej w tkance. Urządzenie wykorzystano do oszacowania współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance nowotworowej. Uzyskana wartość 8.75 x 10-7 cm2s-1 jest zgodna z wartością 9.1 x 10-7 cm2s-1 zgłaszaną wcześniej6 dla raka piersi u ludzi.
| Linia komórkowa | Wymagane stężenie komórek | Czas inkubacji |
| LS174T | 300 komórek/μL | 2-3 dni |
| T47D | 750 komórek/μL | 3-4 dni |
| MDA-MB-231 | 150 komórek/μL | 5–6 dni |
Tabela 1. Parametry dla sferoidów w metodzie wiszącej kropli
| Część | Opis |
| SF | Strzykawka przepływowa |
| SP | Strzykawka do upakowania |
| VFin | Zawór wlotowy przepływu |
| VPin | Zawór wlotowy upakowania |
| VFout | Zawór wylotowy przepływu |
| VPout | Zawór wylotowy upakowania |
Tabela 2. Strzykawki i zawory w układzie przepływowym
Rysunek 1. Schemat układu przepływu VFin i VFout: zawory wlotowe i wylotowe przepływu; VPin i VPout: zawory wlotowe i wylotowe pakowania; SF i SP: strzykawki przepływowe i pakujące. Strzykawka pakująca oraz zawory wlotowe i wylotowe pakowania są wykorzystywane podczas wprowadzania sferoidu do komory. Strzykawka przepływowa oraz zawory wlotowe i wylotowe przepływu służą do późniejszego doprowadzania medium.
Rysunek 2. Schemat sferoidu uwięzionego w komorze urządzenia. Sferoid jest wprowadzany do komory w urządzeniu, gdzie zostaje zatrzymany przez dwa filtrujące słupki znajdujące się w tylnej części komory.
Rycina 3. Dyfuzja doksorubicyny w tkance nowotworowej na urządzeniu. A. Nałożony obraz światła przechodzącego i fluorescencji czerwonej tkanki, pokazujący lokalizację i stężenie doksorubicyny (na czerwono). Pasek skali odpowiada 250 μm. B. Znormalizowany liniowy profil intensywności fluorescencji doksorubicyny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Unaczynienie w guzach nowotworowych jest rzadkie i słabo rozwinięte7,8. Istnieją obszary położone daleko (>100 μm) od naczyń krwionośnych, które są niedostępne dla substancji odżywczych i leków dostarczanych poprzez układ naczyniowy9. Powstałe w ten sposób heterogeniczne mikrośrodowisko przyczynia się do ograniczonej skuteczności wielu środków chemioterapeutycznych10. Opracowane w niniejszej pracy urządzenie mikrofluidyczne odtwarza in vitro heterogeniczne mikrośrodowisko guza, charaktery...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była finansowana z grantu National Institute of Health nr 1R01CA120825-01A1, programu Collaborative Biomedical Research (CBR) na University of Massachusetts Amherst oraz stypendium Isenberg dla Bhushana J. Toleya. Jesteśmy wdzięczni za cenny wkład Jamesa Schafera, operatora wideo, narratora i montażysty tego filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do elastomeru silikonowego | Ellsworth Adhesives | Zestaw Sil Elast 184 | |
| wyci Nowak Miltex | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1,5 mm |
| przewód PTFE | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" Identyfikacja |
| Złącze Luer Lock męskie | Qosina | 65111 | |
| Złączka Luer Lock żeńska z rąbkiem | Qosina | 11556 | |
| Zawór odcinający | Idex Health and Science | P-721 | |
| Łącznik w kształcie litery Y | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1,5" igły | BD Biosciences | 305176 | |
| trypsyna-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Chlorowodorek doksorubicyny | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Linia komórkowa raka jelita grubego człowieka |
| T47D | ATCC | HTB-133 | linia komórkowa raka przewodowego człowieka |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Linia komórkowa gruczolakoraka piersi człowieka |
Bibliografia
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro. Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).
- Walsh, C. L. A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics. Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).
- Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. A mathematical model of drug transport in human breast cancer. Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).
- Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions. Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).
- Brown, J. M., Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).
- Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
