Fluorescencyjnie oznakowana blokada replikacji pośredniczona przez białko represyjne w Escherichia coli

Streszczenie

Źródło: Mettrick, K. A., Lawrence i in., Indukowanie specyficznej blokady replikacji w E. coli przy użyciu systemu operatora tłumiącego fluorescencyjne. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje specyficzną blokadę replikacyjnej widełki w Escherichia coli z wykorzystaniem arabinozowej ekspresji żółtego, fluorescencyjnego białkowego TetR, który wiąże chromosomalne matryce TetO.

Protokół

1. Blokowanie replikacji za pomocą systemu operatora tłumiącego fluorescencję (FROS)

1. Wywołanie blokady replikacyjnej
   1. Rozcieńcz świeżą nocną hodowlę szczepu E. coli z matrycą tetO i pKM118 do OD₆₀₀nm = 0,01 w rozcieńczonym pożywce kompleksowym (0,1% trypton, 0,05% ekstrakt drożdżowy, 0,1% NaCl, 0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K₂HPO₄) z antybiotykami w razie potrzeby selekcji.
      NUTA: Nie dodawaj tetracykliny do selekcji, ponieważ nie jest ona kompatybilna z tym systemem. Spraw, by objętość hodowli była równoważna 10 ml na wymaganą próbkę. Na przykład objętość hodowli dla projektu eksperymentalnego na Rysunku 1 wynosi 60 ml.
   2. Uprawiaj w temperaturze 30 °C z potrząsaniem aż do OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Pobierz próbkę 10 ml, aby służyć jako kontrolę nieindukowaną, i dodaj 0,1% arabinozy do pozostałej hodowli, aby wywołać produkcję TetR-YFP z pKM1. Kontynuuj rozwój zarówno kultur nieindukowanych, jak i wywołanych. Po 1 godzinie sprawdź obecność pojedynczego punktu ogniskowego w każdej komórce indukowanej hodowli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
   3. Jeśli indukowane komórki zostaną zablokowane (ponad 70% komórek ma jeden fokus), zapisz OD₆₀₀nm i pobierz próbkę 7,5 ml do analizy żelami 2D. Pobierz równoważną próbkę z nieindukowanej kultury kontrolnej.

Wyniki

Rysunek 1: Przegląd Bloku Replikacyjnego FROS i procedury eksperymentalnej Release Experimental. Szczepy E. coli niosące układ tetO uprawiane są w temperaturze 30 °C. Gdy komórki osiągają OD₆₀₀nm powyżej 0,05, produkcja TetR...

Materiały