Pętlowa amplifikacja izotermiczna do wykrywania genów bakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Domesle, K. J. i in. Pętlowane wzmacnianie izotermiczne do wykrywania salmonelli w karmach zwierzęcych i potwierdzania izolacji salmonelli w hodowli kulturowej. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje technikę amplifikacji izotermicznej z pętlą (LAMP) do wykrywania docelowego genu bakteryjnego poprzez amplifikację DNA w stałej temperaturze. Mieszanina reakcyjna przygotowuje się poprzez dodanie izotermicznej mieszanki głównej, specyficznych starterów dla docelowego genu oraz próbek zawierających matryce DNA. Amplifikacja jest inicjowana w instrumencie LAMP, a w czasie rzeczywistym monitorowana jest fluorescencja w celu potwierdzenia obecności docelowego genu.

Protokół

UWAGA: Mieszanka reakcji izotermicznej amplifikacji (LAMP) z pętlą zawiera polimerazę DNA, bufor, siarczan magnezu (MgSO₄), trifosforany deoksynukleotydu (dNTP), startery, matrycę DNA oraz wodę. Pierwsze cztery odczynniki znajdują się w izotermicznej mieszance głównej (Tabela materiałów). Podkłady są mieszane wewnętrznie, aby uzyskać mieszankę podkładów (10x). Szablony DNA można przygotować z wzbogacających bulionów z próbek karmy zwierzęcej do celów przesiewowych lub z hodowli domniemanych izolatów Salmonelli w celu potwierdzenia. Ponadto w każdym cyklu LAMP uwzględnia się kontrolę pozytywną (DNA wyodrębnioną z dowolnego szczepu referencyjnego Salmonelli , np. Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) oraz kontrolę bez szablonu (NTC; sterylna woda molekularnej jakości).

1. Przygotowanie szablonów DNA

1. Aby przygotować szablony DNA z wzbogacenia karmy dla zwierząt, postępuj zgodnie z tymi krokami.
   1. Aseptycznie zważ 25 g próbki karmy dla zwierząt (np. suchą karmę dla kotów, suchą karmę dla psów, paszę dla bydła, konie, drób i świnie) do sterylnego worka filtrującego (Tabela materiałów) lub równoważnego. Umieść worek w dużym pojemniku lub stojaku, aby podtrzymał go podczas inkubacji.
   2. Dodaj 225 ml sterylnej wody z buforem peptonowym (BPW). Dobrze wymieszaj, mieszając i wykonując krótki masaż dłoni. Zostaw w temperaturze pokojowej przez 60 ± 5 minut.
   3. Dobrze wymieszaj przez wirujące i określ pH za pomocą papieru testowego. W razie potrzeby dostosuj pH do 6,8 ± 0,2 sterylnym 1N wodorotlenkiem sodu (NaOH) lub 1 N kwasu solnego (HCl). Inkubuj w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
   4. Dobrze wymieszaj, mieszając worek zawierający buliony wzbogacające. Przelej 1 mL z przefiltrowanej strony worka do rurki mikrowirówki. Na krótko Vortex.
   5. Ekstrakt DNA za pomocą odczynnika do przygotowania próbki (Tabela materiałów) jest następujący.
      1. Wirówka w 900 x g przez 1 minutę, aby usunąć duże cząstki i przenieść supernatant do nowej rurki mikrowirówki.
      2. Wiruj w 16 000 x g przez 2 minuty i odrzucaj supernatant.
      3. Zawiesz pellet w 100 μL odczynnika do przygotowania próbki i podgrzej go w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
      4. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać ekstrakty DNA próbki w temperaturze -20 °C.
2. Aby przygotować szablony DNA z domniemanych hodowli Salmonelli , należy postępować zgodnie z tymi krokami.
   1. Uzyskaj domniemane izolaty Salmonelli z izolacji posiewowej we wszystkich produktach spożywczych zgodnie z FDA BAM, rozdział 5, sekcja Salmonella D: Izolacja Salmonelli.
   2. Inokuluje się domniemane izolaty Salmonelli na nieselektywnej płytce agarowej (np. agar krwiowy, agar odżywczy i trypticaza sojowa) i inkubuje się w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
   3. Przełóż kilka pojedynczych kolonii do 5 mL bulionu sojowego tryptazy (TSB) lub bulionu z infuzją mózgu serca (BHI) i inkubuj w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 godziny.
      UWAGA: Ten krok może być opcjonalny, jeśli domniemana kultura Salmonelli jest czysta. W takim przypadku szablony DNA można przygotować poprzez zawieszenie kilku pojedynczych kolonii w 5 mL TSB i podgrzewanie 500 μL zawiesiny w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym. Kontynuuj krok 5 poniżej.
   4. Przelej 500 μL nocnej hodowli do rurki mikrowirówki i podgrzej w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
   5. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać izolowane ekstrakty DNA w temperaturze -20 °C.
3. Aby przygotować DNA z pozytywną kontrolą, należy wykonać podobne kroki jak powyżej, przygotowując szablony DNA z domniemanych hodowli Salmonelli z dodatkowym krokiem rozcieńczenia.
   1. Inokuluj S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) lub dowolne referencyjne szczepy Salmonelli na nieselektywnej płycie agarowej (np. agar krwiowy, agar odżywczy i tryptykazowy agar sojowy) i inkubuj w temperaturze 35 ± 2 °C przez 24 ± 2 godziny.
   2. Przełóż kilka pojedynczych kolonii do 5 mL bulionu TSB lub BHI i wysiabuj w temperaturze 35 ± 2 °C przez 16 ± 2 godziny, aby osiągnąć ~10,9 CFU/mL.
   3. Rozcieńczaj seryjnie nocną hodowlę w 0,1% wodzie peptonowej, aby uzyskać ~10,7 CFU/mL.
   4. Przelej 500 μL tego rozcieńczenia do rurki mikrowirówki i podgrzej w temperaturze 100 ± 1 °C przez 10 minut w suchym bloku grzewczym.
   5. Schłodzić do temperatury pokojowej i przechowywać DNA z dodatnim kontrolem w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie mieszanki podkładowej (10x)

1. Uzyskaj komercyjnie syntetyzowane zapalniki LAMP (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF i Sal4-LB) ze standardowym oczyszczaniem odsalania (Tabela 1). Przygotuj roztwory zapasowe każdego podkładu (100 μM), nawilżając go odpowiednią ilością sterylnej wody molekularnej. Dobrze wymieszać, wirując przez 10 sekund i przechowując w temperaturze -20 °C (do przechowywania długotrwałego -80 °C).
2. Przygotuj mieszankę podkładu (10x) według arkusza (Tabela 2). Dodaj odpowiednie ilości roztworów podkładowych i sterylnej wody molekularnej do rurki mikrowirówki. Dobrze wymieszaj wszystkie odczynniki, wirując przez 10 sekund. Zrób 10x mieszankę spłonów do 500 μL w rurce mikrowirówki i przechowuj w temperaturze -20 °C.

3. Montaż reakcji LAMP

UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, zdecydowanie zaleca się fizyczne oddzielenie obszarów używanych do przygotowania mieszanki LAMP oraz dodawanie szablonów DNA. Rysunek 1 to diagram LAMP.

1. Przygotowanie i przygotowanie do biegu
   1. Umyj stoł izopropanolem oraz roztworem rozkładującym DNA i DNazę (Tabela materiałów). Czyść pipety i uchwyty na paski rurkowe (Tabela materiałów) roztworem degradującym DNA i DNazę.
   2. Rozmroź izotermiczną mieszankę główną, mieszankę podkładów (10x), wodę o jakości molekularnej, DNA z dodatnim kontrolowaniem oraz matryce DNA w temperaturze pokojowej.
   3. Włącz instrument LAMP (Tabela Materiałów) i stuknij ekran otwierający, aby uzyskać dostęp do ekranu głównego. Postępuj zgodnie z tymi krokami, aby stworzyć przebieg.
      UWAGA: Jeden model instrumentu LAMP składa się z 2 bloków (A i B) po 8 próbek w każdym bloku, a inny model ma jeden blok mieszczący 8 próbek (Tabela materiałów).
      1. Stuknij LAMP+Anneal i wybierz Edytuj , aby wprowadzić informacje o próbce.
         UWAGA: Domyślny profil pracy LAMP polega na wzmocnieniu temperatury 65 °C przez 30 minut oraz fazie wyżarzenia od 98 °C do 80 °C z dekrementem 0,05 °C na sekundę.
      2. Stuknij w każdy wiersz próbki, aby aktywować kursor i wprowadzić odpowiednie informacje o próbce, używając ikony bloku AB , aby przełączać się między dwoma blokami instrumentów LAMP.
      3. Kliknij ikonę Sprawdź, gdy wszystkie informacje o próbce zostaną wprowadzone.
         UWAGA: Opcjonalnie konfiguracja run (nazywana "Profile", zawierająca informacje o próbce wraz z domyślnym profilem run LAMP) może być zapisana do późniejszego użytku. Kliknij ikonę Zapisz i nadaj profilowi unikalną nazwę. Podczas następnego testowania tego samego zestawu próbek można zainicjować nowy przebieg za pomocą zapisanego profilu. Kliknij ikonę folderu w lewym dolnym rogu ekranu głównego i wybierz Profil , aby załadować zapisane profile.
2. Zespół reakcji LAMP
   UWAGA: Używając obu bloków instrumentów LAMP (A i B, łącznie 16 próbek), przygotuj master mix LAMP na 18 próbek. Jeśli używasz tylko jednego bloku instrumentów LAMP (łącznie 8 próbek), przygotuj master mix LAMP na 10 próbek. Dla innych liczb próbek dostosuj objętość, aby uwzględnić straty pipetowania. Zawsze włączaj dodatną kontrolę i NTC w każdym przejściu LAMP. Zaleca się podwójne testowanie każdej próbki w niezależnych testach LAMP.
   1. Przygotuj miks master LAMP według arkusza (Tabela 3). Dodaj odpowiednie ilości izotermicznej mieszanki głównej, mieszanki podkładowej oraz wody molekularnej do rurki mikrowirówki i delikatnie wiruj przez 3 sekundy. Krótko wiruj.
   2. Włóż pasek do uchwytu i rozprowadz 23 μL mieszanki głównej LAMP do każdego dołku.
   3. Zrób wszystkie szablony DNA i krótko odpracuj w wirówce. Dodaj 2 μL szablonu DNA do odpowiedniej dołki i mocno zakręć.
   4. Wyjmij pasek z rurki z uchwytu i potrzasnąć nadgarstek, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie tubki.
   5. Załaduj taśmę rurową do bloku przyrządów LAMP, upewniając się, że pokrywy są dobrze zabezpieczone przed zamknięciem pokrywy.

4. LAMP Run

UWAGA: Podczas uruchomienia LAMP odczyty fluorescencji są rejestrowane za pomocą kanału FAM. Wartości do szczytu (Tmax; minimum) są automatycznie określane przez instrument dla punktu czasu, w którym współczynnik fluorescencji osiąga maksymalną wartość krzywej szybkości wzmocnienia. Tm (°C) to temperatura topnienia/wyżarzania końcowego produktu amplifikowanego.

1. Kliknij ikonę Run w prawym górnym rogu ekranu i wybierz blok(y) zawierające paski rurowe, aby rozpocząć bieg LAMP.
2. Opcjonalnie, podczas trwania reakcji, należy stuknąć w zakładki Temperatura, Wzmocnienie i Wyżarzenie , aby zobaczyć dynamiczne zmiany różnych parametrów podczas uruchomienia LAMP.
3. Po zakończeniu serii stuknij zakładki Amplifikacja i Wyżarzenie , aby zobaczyć pełne krzywe amplifikacji i wyżarzenia, a następnie kliknij zakładkę Wyniki , aby zobaczyć wyniki.
4. Opcjonalnie, dla prowadzenia dokumentacji, zapisz numer serii znajdujący się w lewym górnym rogu ekranu, używając formatu "instrument serial number_run number", np. "GEN2-2209_0030."

Tabela 1: Spodki LAMP do przesiewania Salmonelli w karmach dla zwierząt oraz potwierdzania Salmonelli w izolacji hodowlanej. Startery są projektowane na podstawie sekwencji Salmonella invA (numer przystępny GenBank M90846).

Nazwa początkowa	Opis	Sekwencja (5'-3')	Długość (bp)
Sal4-F3	Przedni zewnętrzny zapalnik	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Zewnętrzny spłon odwrócony	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Przedni zapalnik wewnętrzny	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Spodek wewnętrzny do tyłu	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Spłonka pętla do przodu	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Pętla wsteczna sprężyna	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabela 2: Arkusz do przygotowania mieszanki podkładu LAMP (10x). Spłony są wymienione w Tabeli 1.

Składnik	Magazyn fabryczny (μM)	Mieszanka podkładu conc. (μM)	Objętość (μL)
Spłonka Sal4-F3	100	1	10
Spłonka Sal4-B3	100	1	10
Zapalnik Sal4-FIP	100	18	180
Spłonka Sal4-BIP	100	18	180
Spłonka Sal4-LF	100	10	100
Spłonka Sal4-LB	100	10	100
Woda o jakości molekularnej	N/A	N/A	420
Łączny	N/A	N/A	1000

Tabela 3: Arkusz pracy do przygotowania mieszanki reakcji LAMP. Mieszanka spłonników (10x) jest przygotowywana zgodnie z Tabelą 2, używając roztworów zapasowych spłonników wymienionych w Tabeli 1.

Składnik	Działająca konc.	Ostateczna reakcja conc.	Objętość na próbkę (μL)	Objętość dla 18 próbek (μL)	Objętość dla 10 próbek (μL)
ISO-001 izotermiczna mieszanka główna	1,67x	1x	15	270	150
Mieszanka podkładu	10x	1x	2.5	45	25
Woda o jakości molekularnej	N/A	N/A	5.5	99	55
Suma mieszanka główna	N/A	N/A	23	414	230
Szablon DNA	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny diagram przepływu pracy Salmonella LAMP.

Materiały