Dostarczanie biomolekuł fluorescencyjnej do komórek bakteryjnych za pomocą elektroporacji

Streszczenie

Źródło: Aigrain, L. i in. Internalizacja i obserwacja fluorescencyjnych biomolekuł w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji. J. Vis. Exp. (2015)

Film pokazuje dostarczanie fluorescencyjnych biomolekuł do elektrokompetentnych komórek mikrobiologicznych za pomocą elektroporacji. Proces rozpoczyna się od wprowadzenia DNA lub białek oznaczonych fluoroforem do schłodzonej zawiesiny komórkowej. Następnie stosuje się impuls wysokiego napięcia, aby utworzyć tymczasowe pory błonowe, umożliwiając biomolekułom wejście do cytoplazmy. Po odzyskaniu komórki przechodzą płukanie i filtrację w celu usunięcia cząsteczek nieinternalizowanych lub związanych z powierzchnią. Na koniec znakowane komórki są montowane do obrazowania fluorescencyjnego, aby wizualizować komponenty wewnątrzkomórkowe.

Protokół

1. Elektroporacja

1. Inkubacja
   1. Dodaj do 5 μl oznakowanych cząsteczek przechowywanych w buforze niskosolnym (< 50 mM soli) do pojedynczej aliquoty kompetentnych komórek (20 μl bakterii lub 50 μl drożdży) i inkubuj przez 10 minut na lodzie.
      NUTA: Stężenie fluorescencyjnie oznakowanych cząsteczek w roztworach zapasowych, a tym samym ilość oznakowanych cząsteczek dodanych do komórki przed elektroporacją, jest bezpośrednio skorelowane z efektywnością obciążenia (Rysunek 1 i dyskusja). Ponieważ niektóre białka są mniej kompatybilne z warunkami o niskiej zawartości soli, stężenie soli w buforze magazynującym może zostać zwiększone, ale objętość oznakowanych cząsteczek dodanych do komórek przed elektroporacją musi zostać wtedy zmniejszona.
   2. Przenieś mieszaninę komórek i oznakowanych biomolekuł do wcześniej schłodzonej kuwety elektroporacyjnej (odpowiednio 0,1 i 0,2 cm dla bakterii i drożdży). Delikatnie stuknij kuwetą w blat, aby usunąć potencjalne bąbelki z roztworu.
   3. Włóż kuwetę do elektroporatora i zastosuj impuls elektryczny wysokiego napięcia do roztworu (0,9 do 1,8 kV/cm, szczegóły dotyczące wyboru napięcia w sekcji Dyskusja). Taki impuls tworzy przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając dyfundację oznakowanych biomolekuł do komórek.
   4. Sprawdź, czy stała czasowa wyświetlana na elektroporatorze wynosi od 4 do 6 ms. Niższe stałe czasowe często wynikają z zbyt wysokiego stężenia soli i/lub obecności pęcherzyków w kuwecie, co prowadzi do bardzo niskiego lub żadnego obciążenia komórek.
2. Odzyskiwania
   1. Bezpośrednio po elektroporacji należy dodać 500 μl bogatego medium, takiego jak Super Optimal Broth z katabolitową represją (SOC), EZ Rich Defined Medium, ekstrakt drożdżowy Peptone-Dextrose (YPD) lub dowolne bogate medium do komórek.
   2. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C dla bakterii i 29 °C dla drożdży przez 2 do 10 minut. Do pomiarów żywotności, gdzie użytkownik chce ocenić procent komórek rosnących i dzielących się po elektroporacji, należy użyć dłuższego czasu regeneracji (do 1 godziny), ponieważ obserwujemy takie opóźnienia przed pierwszym podziałem komórki.
3. Kroki mycia
   1. Przemyj komórki, aby usunąć nieinternalizowane biomolekuły, obracając komórki przez 1 minutę w temperaturze 3300 x g i 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o stężeniu 500 μl.
      NUTA: Dla każdej próbki przygotuj negatywną kontrolę komórek inkubowanych tą samą ilością oznakowanych biomolekuł, ale nie elektroporanowanych i mytych dokładnie tak samo jak próbka główna.
   2. Powtórz poprzednie kroki 3 razy.
   3. W przypadku internalizacji białka optymalizuj procedurę płukania w zależności od właściwości i zachowania znakowanego białka. Następujące kroki są przykładami możliwych optymalizacji:
      1. Wykonaj pierwsze trzy cykle płukania, używając PBS zawierającego 100 mM NaCl i 0,005% Triton X-100, aby usunąć białka nieinternalizowane, które mogą przykleić się do zewnętrznej błony komórkowej.
         1. Filtruj ogniwa elektroporowane filtrem o średnicy porów 0,22 μm, umieszczonym w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, poprzez pipetowanie elektroporanowanych ogniw do filtra. Skręć przez 3 minuty przy 800 x g i 4 °C. Usuń przepływ. Dodaj 500 μl nowego PBS na komórki i ponownie je obróć jak wcześniej, powtarzając te kroki raz.
      2. Podczas pierwszego cyklu płukania dodaj niewielką ilość proteazy K (10 ng w 500 μl PBS), aby umożliwić trawienie białka nieinternalizowanego.
   4. Rozkręć komórki przez 1 minutę przy 3300 x g i 4 °C. Odrzuć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 150 μl PBS.
   5. Rozprowadź roztwór załadowanego ogniwa na podkładce agarozowej, usuwając górną pokrywę i rozprowadzając kroplę po kropli 10 μl zawiesiny komórkowej. Wymień nieużywaną, czystą, wypaloną pokrywkę (o grubości nr 1,5, odpowiadającej specyfikacji mikroskopu) na górze pada i bardzo delikatnie dociśnij szkiełko.
   6. Chroń elektroporowane ogniwa przed światłem, przechowując je w nieprzezroczystym pudełku podczas obrazowania różnych próbek.

Wyniki

Rysunek 1: Liczenie liczby zinternalizowanych cząsteczek za pomocą analizy fotobielenia. (A) Analiza fotobielenia pojedynczych komórek. Przykłady śladów intensywności fluorescencji (niebieski: dane surowe; czerwone: dopaso...

Materiały