Przygotowanie próbek Myxococcus xanthus do obrazowania żywymi komórkami

Streszczenie

Źródło: Schumacher, D. i in. Obrazowanie żywymi komórkami fluorescencji pełnego cyklu komórkowego wegetatywnego powoli rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie Myxococcus xanthus, powoli rosnącej bakterii glebowej. Hodowla jest uprawiana w podłożu, nakładana na pokrywę fluorescencyjnych mikrosfer i nakładana na podgrzaną agarozę, aby wspierać nawodnienie i dopływ składników odżywczych. Takie rozwiązanie umożliwia długoterminowe, poklatkowe obrazowanie na żywo procesów komórkowych podczas podziału komórek bakteryjnych.

Protokół

1. Przygotowanie próbek mikroskopowych

Nuta: Komórki do obserwacji mikroskopem umieszcza się na pokrywie mikroskopu, a następnie pokrywa się agarozową podkładką zawierającą składniki odżywcze. Pokrywka jest przyklejona do plastikowej lub metalowej ramy, aby zapewnić wsparcie mechaniczne. W przygotowaniu do mikroskopii należy przygotować dużą tamponę z 1% agarozy/TPM/0,2% CTT, zgodnie z krokami 2.1 - 2.3. Prosimy również zapoznać się z Tabelą Materiałów dotyczących konkretnych produktów używanych tutaj.

1. Przygotuj 500 mL buforu TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH₂PO₄ pH 7,6, 8 mM MgSO₄) i sterylizuj autoklaw lub filtr za pomocą filtra na butelce.

NUTA: Bufor sterylny można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.

2. Przygotuj 1% roztwór mikroskopii agarozowej zawierający 0,2% CTT (wymieszaj 1 g agarozy z 80 mL buforu TPM i 20 mL 1% medium CTT). Podgrzewaj w mikrofalówce, aż agaroza się stopi.

NUTA: CTT 0,2% wystarcza, by komórki mogły rosnąć i zapobiegać głodzeniu. Wyższe stężenia CTT w ośrodku mikroskopowym skutkują wysoką fluorescencją tła.

3. Napełnić szalkę Petriego stopioną agarozą do grubości 0,5 cm (dla szalki Petriego o wymiarach 11,5 cm x 11,5 cm kwadratowej wymagane jest około 60 mL stopionej agarozy) i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.

NUTA: Agarozowy pad można przechowywać w temperaturze 4 °C w wilgotnym środowisku do 2 dni.

1. Podgrzej podkładkę 1% agarozy/TPM/0,2% CTT w 32 °C przez co najmniej 15 minut przed użyciem.

NUTA: Aby przygotować komórki do mikroskopii, należy postępować zgodnie z krokami 2.4 - 2.8.

4. Umieść sterylną szklaną pokrywkę (60 mm x 22 mm, grubość: 0,7 mm) na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku (Rysunek 1A); Ta rama służy jako mechaniczne wsparcie dla cienkiego pokrywa i pomaga zmniejszyć dryf podczas mikroskopii. Przymocuj slip do ramy taśmą.

1. Aby przygotować ramę, wyciąć ramę o grubości 75 mm × 25 mm z metalowej płyty o grubości 1 mm, a następnie wyciąć odpowiednio wymiarowy otwór (20 mm × 30 mm w tym eksperymencie) pośrodku.

5. Dodaj 10–20 μL wykładniczo rosnących komórek M. xanthus na pokrywę.

6. Dodanie fluorescencyjnych mikrosfer o średnicy 0,5 μm jako markerów fiducialnych do komórek, aby uprościć śledzenie komórek lub białek w rejestrach poklatkowych czasowych.

1. Rozcieńcz mikrosfery w zakresie 1:100 w buforze TPM i przechowuj w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Dokładnie wstrząśnij przed użyciem i dodaj 5–10 μL rozcieńczonych mikrosfer do komórek.

NUTA: Zastosowano tam mikrosfery fluorescencyjne we wszystkich typowych niebieskich, zielonych, żółtych i czerwonych kanałach fluorescencjowych.

7. Wytnij mały pad o wielkości pokrywy dużej wcześniej podgrzanej podkładki 1% agarozy/TPM/0,2% CTT i umieść ją na ogniwkach (rysunek 1B). Na agarozowej podkładce 1% agarozy/TPM/0,2% CTT połóż pokrywkę, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku.

NUTA: Sama pokrywa zapobiega znacznemu parowaniu przez co najmniej 2 godziny. Dla dłuższych nagrań time-lapse padka CTT o stężeniu 1% agarozy/TPM/0,2% oraz kanapka z pokrywką powinna być uszczelniona folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.

8. Inkubuj próbkę mikroskopii w temperaturze 32 °C przez 15–20 minut, aby komórki mogły przykleić się do spodu agarozowej podkładki. Następnie rozpocznij nagrania z mikroskopii poklatkowej.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat układu eksperymentalnego użytego w trakcie tego badania. (A) Metalowa lub plastikowa rama służy jako wsparcie dla próbki. Do metalowej ramy przymocowana jest taśma pokrywkowa, aby zmniejszyć ruch próbki. (...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMI6000B z AFC	Mikrosystemy Leica	11888945	Zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny z odwróconym polem z adaptacyjnym systemem ostrości
Uniwersalna rama montażowa	Mikrosystemy Leica	11532338	Uchwyt na etap dla różnych rozmiarów próbek
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 OLEJ PH3	Mikrosystemy Leica	11506197	Cel kontrastu fazowego
Aparat Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Kamera sCMOS o rozdzielczości 4,0 megapiksela do akwizycji obrazu
Zestaw filtrów TXR ET, k	Mikrosystemy Leica	11504170	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np. 560/40 Em: 645/75
Zestaw filtrów L5 ET, k	Mikrosystemy Leica	11504166	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np.: 480/40 Em: 527/30
Zestaw filtrów YFP ET, k	Mikrosystemy Leica	11504165	Zestaw filtrów fluorescencyjnych, np.: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Przeor	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Automatyzacja mikroskopu z interaktywnym centrum sterowania
Źródło światła EL 6000	Mikrosystemy Leica	11504115	Zewnętrzne źródło światła fluorescencyjnego
Inkubator BLX Black	Pecon	11532830	komora inkubacyjna otaczająca mikroskop
Tempcontrol 37-2 cyfrowy	Mikrosystemy Leica	11521719	Automatyczna regulacja temperatury dla komory inkubacyjnej
Siarczan gentmycyny	Carl Roth	233.4	Gentamycyna
Oksytetracylinowy dihydrat	Sigma Aldrich	201-212-8	Oksytetracyklina
Siarczan kanamycyny	Carl Roth	T832.3	Kanamycyna
Filtropur BT25 0.2 filtr na wierzch butelki	Sarstedt	831,822,101	Filtr na pokrywce butelek do sterylizacji
Deckgläser	VWR	630-1592	Szklana pokrywa (60 x 22 mm, grubość: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agaroza do preparatów mikroskopowych
Leica Metamorph AF	Mikrosystemy Leica	11640901	Oprogramowanie do sterowania mikroskopem i oprogramowanie do analizy obrazów
Tetraspeck Microsperes, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Fluorescencyjne mikrosfery
Szalka Petriego	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm kwadratowe na podkładki agarozowe
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hydroksymitylo)-aminometan	Carl Roth	AE15.2	Tris
Heptahydrat siarczanu magnezu	Carl Roth	P027.2	Siarczan magnezu
Fosforan diwodoru potasu p.a.	Carl Roth	3904.1	Fosforan diwodoru potasu
Medium CTT 1% (w/v): BD bacto™ casyton, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM buforu fosforanu potasu, pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Podłoże uprawne dla M.xanthus
Bufor TPM: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM bufor fosforanu potasu, pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Bufor do przygotowania preparatów mikroskopowych dla M.xanthus