Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

Streszczenie

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Protokół

1. Badanie aktywności chaperonów z użyciem termicznie rozwijającej się dehydrogenazy malianowej (MDH)

NUTA: Wpływ oczyszczonego HdeB na agregację termicznie rozwijającej się mitochondrialnej mitochondrialnej dehydrogenazy mitochondrialnej (MDH) przy różnych wartościach pH był monitorowany zgodnie z opisaniem poniżej. Wszystkie wymienione stężenia białek odnoszą się do stężenia monomerów.

1. Aby przygotować MDH, należy zdializować MDH w temperaturze 4 °C przez noc przy 4 L buforze C (50 mM fosforanu potasu, 50 mM chlorku sodu (NaCl), pH 7,5) i skoncentrować białko do około 100 μM przy użyciu filtrów odśrodkowych o granicy masy cząsteczkowej 30 kDa.
   NUTA: Wymagana jest staranna dializa MDH, ponieważ MDH podaje się w formie roztworu siarczanu amonu.
2. Aby usunąć agregaty, wiruj białko przez 20 minut w ilości 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Określ stężenie MDH na podstawie absorpcji 280 nm (ε_{280 nm} = 7 950 ^{M-1 cm-1}). Przygotuj 50 μl alikwotów MDH i zamroz je błyskowo do przechowywania.
3. Włóż kwarcową kuwetę o pojemności 1 ml do spektrofotometru fluorescencyjnego wyposażonego w uchwyty i mieszadła do próbek o kontrolowaniu temperatury. Ustaw λ_ex/em na 350 nm.
4. Dodaj odpowiednie objętości wcześniej podgrzanego (43 °C) buforu D (150 mM fosforanu potasu, 150 mM NaCl) przy pożądanych wartościach pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 i pH 5,0) do kuwety i ustaw temperaturę w uchwytie na 43 °C. Całkowita objętość wynosi 1 000 μl.
5. Dodaj do bufora 12,5 μM HdeB (lub alternatywnie tę samą objętość bufora pamięci HdeB dla kontroli bufora), a następnie dodaj 0,5 μM MDH. Zacznij monitorować rozpraszanie światła. Inkubuj reakcję przez 360 sekund, aby umożliwić odpowiednie rozwinięcie MDH.
6. Podnieś pH do 7, dodając objętość 0,16-0,34 2 M niebuforowanego K₂HPO₄ i kontynuuj rejestrowanie rozpraszania światła przez kolejne 440 sekund.
7. Ustaw zakres agregacji MDH rejestrowany w nieobecności opiekuna w określonym momencie po neutralizacji (dalej 500 sekund, gdy obserwowano maksymalne rozpraszanie światła MDH) na 100%. Normalizuj aktywność HdeB do sygnału rozpraszania światła MDH przy braku HdeB przy każdej wskazanej wartości pH.

Materiały