Ocena ochrony roli chaperonu aktywowanego kwasem w E. coli pod wpływem stresu kwasowego

Streszczenie

Źródło: Dahl, J. i inni. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film pokazuje stosowanie rekombinowanych hodowli E. coli do oceny ochronnego efektu kwasowo aktywowanego chaperonu podczas stresu kwasowego. Monitorowanie wzrostu bakterii wykazuje zwiększoną przeżywalność w hodowlach ekspresujących chaperony w porównaniu z grupami kontrolnymi, podkreślając rolę chaperonów w stabilizacji białek w warunkach stresu.

Protokół

1. Wpływ nadekspresji HdeB w Chaperone na przeżycie E. coli pod wpływem stresu kwasowego

UWAGA: DNA genomowe E. coli MG1655 zostało wyizolowane według standardowego protokołu.

1. Wzmocnij chaperone, hdeB z E. coli MG1655 za pomocą PCR, używając spłonników hdeB-BamH I-rev, GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT ATT CAA GTC ATT oraz hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C, C, C.
2. Ustaw reakcję PCR w 50 μl w następujący sposób: 10 μl 5x bufor polimerazy, 200 μM dNTP, 0,5 μM podkład JUD2, 0,5 μM primer JUD5, 150 ng genomowego DNA MG1655, 0,5 μl polimerazy DNA, dodaj ddH₂O do 50 μl.
3. Wykonaj amplifikację hdeB w następujący sposób: Krok 1: 5 minut w 95 °C, 1 cykl; Krok 2: 30 sekund w 95 °C, 30 sekund w 55 °C, 30 sekund w 72 °C, 40 cykli; Krok 3: 10 minut w 72 °C.
4. Klonowanie powstałego fragmentu PCR do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pBAD18 przy użyciu standardowych metod klonowania miejsc restrykcyjnych. Oczyszcz plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikowaj powstały plazmid poprzez sekwencjonowanie.
5. Przekształcić plazmid ekspresujący HdeB lub pusty wektor sterujący pBAD18 w szczep BB7224 (ΔrpoH) (genotyp: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(:IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) używając chemicznie kompetentnych komórek.
   NUTA: Ten szczep jest wrażliwy na temperaturę.
6. Po 45 sekundach szoku cieplnego w temperaturze 42 °C i przed powlekaniem inkubuj komórki w temperaturze 30 °C i 200 obr./min. Wykonaj pojedyncze wyciskanie klonów pozytywnych i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C. Przygotuj nocną hodowlę w 50 ml LB_Amp i hoduj komórki w 200 obr./min i 30 °C.
7. Rozcieńczaj hodowle nocne 40-krotnie do 25 ml_{LB Amp} i hoduj bakterie w obecności 0,5% arabinozy (Ara) w temperaturze 30 °C i 200 obr./min, aby wywoływać ekspresję białek HdeB.
8. W eksperymentach z przesunięciem pH użyj_{LB Amp+Ara} do rozcieńczenia komórek do _O.D.600nm 0,5 i dostosowania do odpowiednich wartości pH (tutaj: pH 2,0, pH 3,0 i pH 4,0) poprzez dodanie odpowiednich objętości 5 M HCl.
9. Po wskazanych punktach czasowych (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min) zneutralizuj hodowle, dodając odpowiednie objętości 5 M NaOH.
10. Monitoruj wzrost zneutralizowanych hodowli w hodowli ciekłej przez 12 godzin w temperaturze 30 °C, stosując pomiary przedawkowania.

Materiały