Ekstrakcja genomowego DNA oparta na lizie termicznej z patogennej bakterii

Streszczenie

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).

Protokół ten wyodrębnia genomowe DNA z Yersinia ruckeri poprzez zawieszenie izolowanych kolonii w ultraczystej wodzie i zastosowanie ciepła w celu lizy komórek. Wirowanie oddziela supernatant zawierający DNA od pozostałości komórkowych, co daje DNA szablonowe odpowiednie do genotypowania i analizy epidemiologicznej opartej na PCR.

Protokół

1. Hodowla i ekstrakcja DNA genomowego

1. Wysiewaj kultury czyste Y. ruckeri na dowolnym odpowiednim typie agaru (autorzy używali 5% agaru z krwią bydła) i inkubuj w temperaturze 22 °C przez 1-2 dni lub 15 °C przez 3-4 dni.
2. Z każdej płytki agarowej wybierz jedną reprezentatywną kolonię z pętlą inokulacyjną i przenieś ją do 1,5 mL rurek wirówkowych zawierających 50 μL ultraoczyszczonej wody. Zawiesz, krótko zawiesić i inkubować przez 7 minut na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C.
3. Wiruj w 16 000 x g przez 3 minuty i użyj pipety, aby ostrożnie przenieść supernatant do pustej rurki wirówki 1,5 mL. Przechodź do kolejnego kroku, używając supernatantu jako szablonowego DNA lub przechowuj w temperaturze -20 °C do tego momentu.

Materiały