Wystawienie syntetycznej społeczności bakteryjnej jamy ustnej na symulowane fazy trawienia

Streszczenie

Źródło: Arroyo, M. C. i in. Ocena opłacalności syntetycznego konsorcjum bakteryjnego na interfejsie in vitro jelito-mikroorganizm. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje ocenę żywotności syntetycznej społeczności mikroorganizmów jamy ustnej podczas symulowanego trawienia jamy ustnej, żołądkowej i jelitowej. Przeżywalność bakterii jest mierzona po każdej fazie, co ujawnia postępujący spadek z powodu stresu trawiennego.

Protokół

1. Przeżycie bakterii po warunkach tranzytu in vitro przez układ przewodu pokarmowego

NUTA: Przygotuj symulowane płyny trawienne z modyfikacjami opisanymi poniżej. Przygotuj wszystkie rozcieńczenia w ultraczystej wodzie. Wszystkie roztwory sterylizować filtrem przez filtr 0,22 μm i wykonać proces trawienia w warunkach sterylnych.

1. Trawienie jamy ustnej:
   1. Włóż 3 mL społeczności bakteryjnej do 50 mL sterylnej probówki, wymieszaj z 3 mL symulowanego płynu ślinowego (SSF), zawierającego w milimolach na litr (mmol L⁻¹): chlorek potasu (KCl), 15,1; Fosforan monopotasu (KH₂PO₄), 3,7; Wodorowęglan sodu (NaHCO₃), 6,8; Chlorek magnezu w heksahydracie (MgCl₂·6H₂O), 0,5, węglan amonu [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Kwas solny (HCl), 1.1; Chlorek wapnia (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Dodaj 75 U/mL α-amylazy z ludzkiej śliny typu IX-A oraz 2 g/L śluzy z żołądka wieprzowego (typ II) do SSF.
   2. Inkubuj mieszankę przez 2 minuty w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę o pojemności 2 mL do ekstrakcji DNA i ilościowej analizy cytometrii przepływowej (S1).

2. Trawienie żołądka:

1. Dodaj 4 mL symulowanego płynu żołądkowego (SGF), zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Chlorek sodu (NaCl), 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Ponadto SGF zawierała 2 g/L śluzu z żołądka wieprzowego (typ II).
2. Zmierz pH i dostosuj pH do 3 z 1 molem (1 M) HCl, jeśli trzeba. Inkubować w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę 2 mL (S2).

3. Trawienie jelita cienkiego:

1. Dodaj 4 mL symulowanego płynu jelitowego (SIF) zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, do rurki trawiennej.
2. Jeśli trzeba, dostosuj pH do pH 7 z 1 milionem wodorotlenku sodu (NaOH). Inkubować w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę 2 mL (S3).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Śluz z żołądka wieprzowego typu II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Akademicki system Millipore Milli-Q, ultra czysta woda	Millipore, Merck KGaA	-
Wstrząsniak inkubatorowy InnOva 4080	New Brunswick Scientific	8261-30-1007
Woda wolna od nukleazy	Elektroforeza serva	28539010
Cytometr przepływowy BD Accuri C6	BD Biosciences	653118
Zestaw PCRpure InnuPREP	Analytik Jena	845-KS-5010250	Zestaw do oczyszczania PCR