Ekstrakcja DNA genomowego z tkanek liści roślin zakażonych bakteriami patogennymi

Streszczenie

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).

Protokół ten wyodrębnia genomowe DNA z Yersinia ruckeri poprzez zawieszenie izolowanych kolonii w ultraczystej wodzie i zastosowanie ciepła w celu lizy komórek. Wirowanie oddziela supernatant zawierający DNA od pozostałości komórkowych, co daje DNA szablonowe odpowiednie do genotypowania i analizy epidemiologicznej opartej na PCR.

Protokół

1. Hodowla i ekstrakcja DNA genomowego

1. Wysiewaj kultury czyste Y. ruckeri na dowolnym odpowiednim typie agaru (autorzy używali 5% agaru z krwią bydła) i inkubuj w temperaturze 22 °C przez 1-2 dni lub 15 °C przez 3-4 dni.
2. Z każdej płytki agarowej wybierz jedną reprezentatywną kolonię z pętlą inokulacyjną i przenieś ją do 1,5 mL rurek wirówkowych zawierających 50 μL ultraoczyszczonej wody. Zawiesz, krótko zawiesić i inkubować przez 7 minut na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C.
3. Wiruj w 16 000 x g przez 3 minuty i użyj pipety, aby ostrożnie przenieść supernatant do pustej rurki wirówki 1,5 mL. Przechodź do kolejnego kroku, używając supernatantu jako szablonowego DNA lub przechowuj w temperaturze -20 °C do tego momentu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard	Promega	A1120	Źródło lizy jąder, RNazy, wytrącenia białek oraz roztworów rehydratacji DNA
Ciekły azot	Produkty powietrzne	N/A
Mastercycler Pro z panelem sterowania	Eppendorf	6321000019
Mikrofala 1250 W	Panasonic	N/A
Wirówka stołowa 5424	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 do cyfrowej kąpieli wodnej	Fisher Scientific	15-462-15Q
Metalowa szpatułka	Sigma-Aldrich	Z283274
Moździerzz i tłuczek	Sigma-Aldrich	Z247464
Mieszacz Vortex LSE	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterylne końcówki 10 μL	TipOne	1161-3730
Sterylne końcówki 200 μL	TipOne	1163-1730
Sterylne końcówki 1250 μL	TipOne	1161-1750
Zestaw pipetor o zmiennej objętości	VWR	75788-460
Bromek etidy	Sigma-Aldrich	E1510
Agarozy	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Kwas octowy	Fisher Chemical	A38-212
Baza Tris	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Podstawy biospektrometru	Eppendorf	6135000009