Miękki test agarowy do wykrywania zabijania podsycaniego bakteriocyną u strzykawek Pseudomonas

Streszczenie

Źródło: Hockett, K. L. i Baltrus, D. A. Zastosowanie techniki nakładki miękkiego agaru do wykrywania związków hamujących produkowanych przez bakterie. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje procedurę wykrywania zabijania podpłynionego bakteriocyną poprzez wykrycie supernatantu szczepu dawcy wywołanego antybiotykiem na miękkiej warstwie agaru zawierającej szczep testowy. Strefy przezroczyste powstałe po inkubacji wskazują na hamowanie bakterii.

Protokół

1. Przygotowanie nakładek i testowanie supernatantów pod kątem aktywności

1. Zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu P. syringae do testu na wrażliwość w 3 ml KB (medium King's B), inkubować przez noc z potrząskiem w temperaturze pokojowej.
2. Następnego ranka rozcieńcz hodowlę w 1/100 do świeżej księżnicy. Inkubuj 3-4 godziny z potrząsaniem w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj sterylny agar wodny, poddając agar w ultraczystej wodzie przez autoklawowanie zawiesina o stężeniu 0,35-0,7% (w/v).
   NUTA: Zapas miękkiego agaru można stopić w mikrofalówce i wielokrotnie go używać; Nie trzeba przygotowywać nowej nakładki na każdy eksperyment. Jeśli agar wodny jest ponownie używany, kluczowe jest, aby po podgrzewaniu w mikrofalówce całkowicie się rozpuścił. Jeśli nie, nakładka będzie miała ziarnistą fakturę po zakryciu, co utrudnia interpretację.
4. Przed użyciem utrzymuj stopiony miękki agar w kąpieli wodnej w temperaturze 60 °C. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przelej 3 ml miękkiego agaru do probówki do sterylnej hodowli. Wróć rurkę hodowlę do kąpieli wodnej, aby utrzymać stan stopiony.
5. Aby wylać warstwę, najpierw pozwól stopionemu agarowi ostygnąć (powinien być ciepły, ale nie gorący w dotyku), ale nie pozwól mu się zastygnąć.
6. W sterylnym kapturze zaszczep 100 μl kultury testowej do miękkiego agaru i wiru w celu wymieszania. Rotuj hodowlę ręcznie przez 10-15 sekund, a następnie wylej na agar od dna (KB agar). Przechyl płytkę we wszystkich kierunkach, aby miękki agar równomiernie pokrywał dolny agar.
   NUTA: Agar dolny może być dowolnym zastygłym (1,5% agaru), na którym szczep testowy intensywnie rośnie. Dla standardowej szalki Petriego o średnicy 100 mm użyj ~20 ml roztopionego medium. Agar dolny można przygotować kilka tygodni wcześniej (jeśli utrzymuje się w temperaturze 4 °C bez suszenia) lub tego samego dnia.
7. Przykryj talerz i pozwól mu zestygnąć przez 20-30 minut. Uważaj, żeby nie ruszyć płyty podczas jej twardzenia.
8. Po zastygnięciu nałóż 2-5 μl supernatantu na nakładkę. Pozwól płytkom wysiąść się przez noc w temperaturze pokojowej. Obserwuj i zapisuj wyniki następnego ranka.
   NUTA: Może być przydatne do wykonania i wykrycia z szeregowego rozcieńczenia supernatantu. Pozwoli to naukowcom rozróżnić aktywność usuwania bakteriofagów od bakteriocyn. W takim przypadku zaleca się przeprowadzanie rozcieńczeń 1:5 lub 1:10.

Materiały