Izolacja bakterii adaptowanych do stresu poprzez selekcję pojedynczej kolonii

Streszczenie

Źródło: Jeong, H., i inni. Procedura adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej mikroorganizmów z użyciem chemostatu. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje selektywną izolację i rozwój bakterii przystosowanych do stresu z hodowli narażonej na długotrwały stres. Kultura jest nakładana na agarze zawierającym stresor, a pojedyncza kolonia jest wybierana do inokulacji ciekłego medium stresorem. Absorpcja jest mierzona w regularnych odstępach czasu, aby monitorować wzrost i potwierdzić skuteczną izolację bakterii przystosowanych do stresu.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu

1. Zdobądź słoik chemostat (150-250 ml) lub kolbę Erlenmeyera (250 ml) zawierającą port wlotowy i port wylotowy. Łącz porty rurkami silikonowymi, co pozwala na przepływ 10-100 ml/h. Opcjonalnie można użyć odpowietrza powietrza, portu wylotowego oraz wlotów i wylotów wody z regulowaną temperaturą.
2. Zdobądź urządzenie odpowiednie do słoika chemostat, które umożliwia mieszanie i kontrolę temperatury (lub użyj inkubatora obrotowego do wstrząsania).
3. Zdobądź dwie pompy perystaltyczne, aby dostarczyć świeże medium i zebrać kulturę.
4. Zdobądź zbiornikowy słoik (10-20 L) zawierający średni port wylotowy i wlot powietrza.
5. Uzyskaj rurki krzemowe odpowiednie do szybkości rozcieńczania (tj. średnica 0,8 mm, zakres przepływu 0,06-36 ml/min; rurka L/S 13).

2. Przygotowanie i sterylizacja podłoża

1. Medium początkowe
   1. Rozpuszcz 0,3 g glukozy, 0,08 g chlorku amonu (NH₄Cl), 0,05 g chlorku sodu (NaCl), 0,75 g disodowego fosforanu wodoru (Na₂HPO_{4,2H 2}O) oraz 0,3 g disodowego fosforanu wodoru (KH₂PO₄) w 90 mL wody destylowanej (D.W.) w słoiku chemostatowym.
   2. Zamknij słoik chemostat razem z rurką za pomocą zacisków. Nie uszczelniaj nawiewu.
   3. Sterylizuj słoik chemostat w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji przechowuj słoik chemostat w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuścić 0,02 g siarczanu magnezu heptahydratowego (MgSO 4,7H₂O), 0,01 g chlorku wapnia (CaCl₂) oraz 0,1 mg tiaminy w 10 mL D.W. (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A z użyciem strzykawki i wstępnie sterylizowanego filtra strzykawkowego (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodaj roztwór A filtrat do słoika chemostat.
2. Ośrodek naprężeń
   1. Rozpuszcz 30 g glukozy, 8 g NH₄Cl, 5 g NaCl, 75 g Na₂HPO_{4,2H 2}O, 30 g KH₂PO₄ oraz 300 g heksahydratu sodowego succynianu (Na₂·succynan·6H_2O; stresor używany w tym eksperymencie) w pojemniku rezerwuarowym.
   2. Uszczelnij słoik zbiornika wraz z rurką za pomocą zacisków. Nie uszczelniaj nawiewu.
   3. Sterylizuj słoik rezerwuarowy w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Po sterylizacji przechowuj słoik w temperaturze pokojowej.
   4. Rozpuszcz 2 g MgSO 4,7H ₂O, 1 g CaCl₂ oraz 10 mg tiaminy w 100 ml D.W. (roztwór A).
   5. Roztwór filtracyjny A z użyciem strzykawki i wstępnie sterylizowanego filtra strzykawkowego (filtr porowy 0,45 μm).
   6. Dodaj filtrat roztworu A do słoika rezerwuarowego.
   7. Aseptycznie podłącz sterylizowaną rurkę krzemową do zbiornika i podłącz pompy perystaltyczne.
3. Medium o wysokim stresie
   1. Przygotuj podłoże zgodnie z sekcją 2.2, ale z większym stężeniem stresora (czyli o 3-5 g/L wyższym w adaptacji sukcynatowej).
      Uwaga: Protokół ten służy do adaptacji do naprężenia, które może być dostarczone przez medium. W przypadku czynników fizycznych, takich jak temperatura, mieszanie czy oświetlenie, uprawa powinna być odpowiednio zaprojektowana.

3. Początkowa uprawa

1. Zaszczep pojedynczą kolonię dzikich Escherichia coli (E. coli) w probówce o pojemności 15 ml, zawierającej 4 ml podłoża początkowego.
2. Inkubuj probówkę w inkubatorze wstrząsającym przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min.
3. Aseptycznie przelej 1 ml prekultury do słoika chemostat.
4. Inkubuj słoik chemostat, zapewniając napowietrzanie (powietrze 50 ml/min) i mieszanie (200 obr./min), w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.

4. Adaptacja do stresu

1. Aseptycznie połącz koniec rurki krzemowej od pomp do słoika chemostat.
2. Uruchom pompę wylotową (10 ml/h lub więcej) i pobierz hodowlę. Uwaga: Hodowla powinna być w fazie wykładniczej, zazwyczaj 4-8 godzin po początkowej uprawie.
3. Sprawdź gęstość optyczną (600 nm) hodowli z rurki wylotowej.
4. Uruchom pompę wlotową (10 ml/h, co odpowiada szybkości rozcieńczania 0,1 h-1).
5. Co 24 godziny sprawdzaj gęstość optyczną hodowli na 600 nm od rurki wylotowej.
6. Obsługuj chemostat przez 96 godzin (9,6-krotna rotacja) lub dłużej. Jeśli gęstość optyczna jest stabilna, wymień złoże zawierające ośrodek o wysokim naprężeniu. Jeśli gęstość optyczna jest niższa niż 0,2, zatrzymaj pompę wlotową na 6 godzin. Ponownie uruchom pompę wlotową i sprawdź, czy gęstość optyczna przekracza 0,2.
7. Stopniowo zwiększać stężenie stresora, zmieniając go na zbiornik zawierający wyższe stężenie stresora.
8. Pobierać próbki z przystosowanej hodowli za każdym razem, gdy osiąga ona ważny kamień milowy (np. szczep przystosowany do stresu sukcynatu 100 g/L) i przechowywać je do dalszej analizy genomowej.
9. Do przechowywania próbki wymieszaj próbkę hodowli (0,5 ml) ze sterylnym roztworem glicerolu 80% (0,5 ml) i przechowywaj ją w temperaturze -80 °C. Uwaga: Jeśli mikroorganizm nabierze zdolności do rozkładu stresora podczas procesu ALE, stężenie stresora w fermentacyjnym słoiku nie jest takie samo jak w świeżym rezerwuarze.

5. Izolacja pojedynczej kolonii szczepu adaptowanego do stresu

1. Przygotuj medium na talerzu agarowym (1,6% agar) zawierającego ten sam stresor i w tym samym stężeniu medium.
2. Nakładaj hodowlę wylotową (0,1 ml) z chemostatu i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
3. Pobieraj pojedyncze kolonie z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczepiaj je w probówkach 15 ml zawierających ten sam stresor i w tym samym stężeniu co w chemiocie, a następnie inkubuj przez 6 godzin.
4. Przelej 1 ml bulionu hodowlowego do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 50 ml podłoża. Zbieraj 0,5 ml bulionu hodowlanego co 1 godzinę i mierz przedawkowanie przy 600 nm. Porównaj tempo wzrostu szczepu adaptowanego z tempem wzrostu szczepu typu dzikiego przy danym stresorze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fermentor mini-chemostat	Biotron Inc.	-	wyprodukowano na specjalne zamówienie
Rurki krzemowe	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	Rozmiar rurki można zmieniać w zależności od szybkości rozcieńczenia i wielkości słoika fermentorowego.
Zbiornik rezerwowy	Bellco	Butelka do przechowywania nośników	20 L
Chemikalia	Sigma-Aldrich	-	Stopień odczynników
Glukoza	Sigma-Aldrich	G5767	Odczynnik ACS
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	dla biologii molekularnej, odpowiedniej do hodowli komórek, ≥99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	Odczynnik ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	Odczynnik ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	Odczynnik ACS, ≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	Odczynnik ACS, ≥96%
Tiamina·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	Poziom odczynnikowy, ≥99%
Na₂succynate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%