1. Zbieranie i magazynowanie wody oraz koralowców do izolacji mikroorganizmów
NUTA: Niezbędne jest zebranie współrzędnych i temperatury miejsc pobierania próbek. Jeśli to możliwe, metadane takie jak zasolenie, pH, głębokość i natężenie światła mogą również pomóc w znalezieniu precyzyjnie dopracowanych metod uprawy i przyszłej interpretacji danych. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, przechowuj próbki przez jak najdłuższy czas. Mikrobiom wody/koralowca może ulec znacznej zmianie, jeśli próbki nie są utrzymywane w odpowiedniej temperaturze i/lub przechowywane przez długi czas. Jeśli etap izolacji nie jest wykonywany natychmiast po pobraniu, kluczowe jest utrzymanie próbek w temperaturze 4 °C aż do przetworzenia. Im dłużej próbki są przechowywane, nawet w temperaturze 4 °C, tym bardziej zmienia się społeczność mikroorganizmów.
- Pobieraj próbki i przechowuj wodę morską.
- Pobierz próbki wody po 500 mL w co najmniej potrójnych egzemplarzach z każdego docelowego miejsca pobierania próbek. Najlepiej używać sterylnych butelek z zakrętkami.
- Jeśli przetwarzasz wodę natychmiast po zebraniu, trzymaj butelki na RT przez krótki czas. Jeśli proces pobierania próbek następuje później, utrzymuj butelki w temperaturze 4 °C.
- Próbkować i przechować koralowce.
- Użyj sterylnych szczypiec, aby wyciąć fragmenty koralowców z tego samego miejsca pobierania próbek wody. Aby uniknąć skażenia, dotykaj koralowców wyłącznie sterylnymi rękawiczkami.
- Przepłucz pobrany fragment koralowca za pomocą 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (3% NaCl w wodzie destylowanej) lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przyklejonych wolno żyjących bakterii z wody morskiej wody.
- Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku o pojemności 250−500 mL z nakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej.
- W laboratorium, używając sterylnych kleszczy i szczypiec, waż 5 g fragmentów koralowców za pomocą sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm na wadze.
- Przelej 5 g próbki koralowca do sterylnego moździerza i rozmasakruj ją sterylnym tłuczkiem.
- Za pomocą sterylnej łopatki przenieś próbkę macerowanego do kolby z 45 mL 3% roztworu NaCl oraz 10−15 szklanych kulek o średnicy 5 mm. Użyj 45 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej do przemycia zaprawy i odzyskania maksymalnej ilości macerianu.
- Utrzymuj kolby w stałym mieszaniu (150 x g) przez 16 godzin przy temperaturze wody w miejscu pobierania próbek.
NUTA: Dla koralowców płytkowodnych optymalna temperatura wynosi 24−28 °C. Ten etap odłącza mikroorganizmy od różnych przedziałów koralowców, takich jak te przymocowane do komórek gospodarza lub te żyjące wewnątrz tkanki i szkieletu. Po tym kroku maceracje koralowców nie powinny być przechowywane, a etap izolacji należy wykonać natychmiast.
2. Izolacja syntetycznych bakterii degradujących estrogen 17a-etynelokradiol (EE2) z wody morskiej i/lub koralowców
- Wybierz bakterie.
NUTA: Po krokach 1.1.2 i 1.2.7 stężenie mikroorganizmów w wodzie morskiej, które odłączyły się od różnych maceratów koralowców, będzie nieznane i zmienne. Aby zagwarantować izolację pojedynczych kolonii mikroorganizmów w szalkach Petriego zawierających media agarowe, konieczne są seryjne rozcieńczenia.- Przeprowadzaj seryjne rozcieńczenia do 10-9 w bezpłodnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców oraz do 10-6 dla próbek wody. Pipeta rozcieńcza się 5 razy w górę i w dół, zanim wyrzuci końcówkę. Vortex pobiera próbki przez 5 sekund za każdym razem przed kolejnym rozcieńczeniem seryjnym.
- Pipetować 100 μL każdej rozcieńczeniny na szalkach Petriego zawierających 3% bulionu lizogenicznego (LB) z agaru i wyleść je na talerz.
NUTA: Użyj agaru morskiego (MA) jako alternatywnego medium. Dla wiarygodnych wyników wymagane są trójkopie każdego rozcieńczenia. - Inkubuj płytki przez 1−3 dni w docelowej temperaturze (np. 26 °C). Sprawdzam tablice raz dziennie.
- Wybieraj i izoluj kolonie o wyraźnych morfologiach wzrostu na nowych płytkach za pomocą techniki płyt spaskowanych. Powtarzaj ten krok tyle razy, ile trzeba, aby na talerzach rosły czyste kolonie.
- Jeśli procedura nie zostanie natychmiast kontynuowana do etapu 2.3.1, przechowuj izolaty w temperaturze 4 °C lub w glicerolu, jak opisano w sekcji 2.2.
- Przygotuj bulje glicerolu.
NUTA: Ten etap jest opcjonalny i może być wykorzystywany do długoterminowego przechowywania zapasów bakteryjnych.- Zbierz pojedyncze kolonie z świeżej płytki lub z płytek przechowywanych w 4 °C i niezależnie zaszczep je w 2 mL sterylnego medium LB.
- Umieść rurki w stałym mieszaniu (150 x g) w temperaturze 24−28 °C przez noc (ON).
- Dodaj 1 ml hodowli bakteryjnych z etapu 2.2.2 i sterylnego glicerolu do końcowego stężenia 20% do 2 mL kriovialów.
- Zostaw krioviale włączone w temperaturze 4 °C.
- Umieść zapasy bakterii glicerolu w temperaturze -80 °C do czasu potrzeby.
- Wykonaj test zdolności degradacji EE2.
- Aktywuj izolaty w bulionie LB lub alternatywnych mediach. W tym celu wybierz pojedynczą kolonię ze świeżych płytek lub z płytki przechowywanej w 4 °C i zaszczep 2 mL bezpłodnego medium LB. Jeśli jest to bulion glicerolowy, najpierw rozproszyj go na płytkach agarowych LB i inkubuj w temperaturze 24−28 °C ON, aby wyrosły pojedyncze kolonie. Umieść rurkę zawierającą medium LB pod stałym mieszaniem (150 x g) w temperaturze 24−28 °C ON.
- Po wzroście bakterii rozpyl komórki, wirując je w 8 000 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń supernatant i, delikatnie pipiturując w górę i w dół, ponownie zawiesij komórki w równej objętości (2 mL) wody solnej, aby przepłukać pozostały bulion LB.
- Powtórz krok 2.3.2 dwa razy, aby upewnić się, że nie ma śladów źródła węgla, zawieszając komórki w równej objętości roztworu soli fizjologicznej. Na przykład, jeśli rozpoczęto od hodowli 2 mL, należy ponownie zawiesić komórki w ostatecznej objętości 2 mL roztworu soli fizjologicznej.
- Zaszczepić wyprane i ponownie zawiesowane komórki w minimalnym pożywce hodowlanym Bushnell Haas (BH Briot) zawierającym EE2 jako jedyne źródło węgla.
NUTA: EE2 rozpuszcza się w etanolu przy końcowym stężeniu 5 mg/L w pożywce hodowlowej. W razie potrzeby zmień rodzaj i/lub stężenie zanieczyszczeń. - Oceń wzrost bakterii na podstawie gęstości optycznej na 600 nm i/lub jednostek tworzących kolonie (CFU) na medium agarowym LB, przez 16−72 godziny inkubacji.
NUTA: Alternatywnie, mikroorganizmy można bezpośrednio izolować na minimalnym nośniku zawierającym EE2 lub inne związki jako jedyne źródło węgla. Ten krok miał kierować selekcją i zapobiegać niepożądanemu wzrostowi.