Selektywne wzbogacanie i izolacja bakterii morskich degradujących ropę z próbek wody morskiej

Streszczenie

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje selektywną izolację bakterii morskich degradujących ropę poprzez wzbogacanie próbek wody morskiej na nośnikach olejowych, co umożliwia odzyskiwanie czystych szczepów z potencjalnymi zastosowaniami w bioremediacji ropy naftowej i oczyszczaniu środowiska.

Protokół

1. Zbieranie i magazynowanie wody oraz koralowców do izolacji mikroorganizmów

NUTA: Niezbędne jest zebranie współrzędnych i temperatury miejsc pobierania próbek. Jeśli to możliwe, metadane takie jak zasolenie, pH, głębokość i natężenie światła mogą również pomóc w znalezieniu precyzyjnie dopracowanych metod uprawy i przyszłej interpretacji danych. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, przechowuj próbki przez jak najdłuższy czas. Mikrobiom wody/koralowca może ulec znacznej zmianie, jeśli próbki nie są utrzymywane w odpowiedniej temperaturze i/lub przechowywane przez długi czas. Jeśli etap izolacji nie jest wykonywany natychmiast po pobraniu, kluczowe jest utrzymanie próbek w temperaturze 4 °C aż do przetworzenia. Im dłużej próbki są przechowywane, nawet w temperaturze 4 °C, tym bardziej zmienia się społeczność mikroorganizmów.

1. Pobieraj próbki i przechowuj wodę morską.
   1. Pobierz 500 mL próbek wody co najmniej trzykrotnie z każdego docelowego miejsca pobierania próbek. Najlepiej używać jałowych butelek z zakrętkami.
   2. Jeśli przetwarzasz wodę natychmiast po zebraniu, trzymaj butelki w temperaturze pokojowej (RT) przez krótki czas. Jeśli proces pobierania próbek następuje później, utrzymuj butelki w temperaturze 4 °C.
2. Próbkować i przechować koralowce.
   1. Użyj sterylnych szczypiec, aby wyciąć fragmenty koralowca z tego samego miejsca pobierania próbek co próbki wody. Aby uniknąć skażenia, dotykaj koralowców wyłącznie sterylnymi rękawiczkami.
   2. Przepłucz pobrany fragment koralowca za pomocą 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (3% NaCl (chlorek sodu) w wodzie destylowanej) lub sztucznej wody morskiej, aby pozbyć się luźno przymocowanych wolno żyjących bakterii z wody morskiej.
   3. Za pomocą kleszczy umieść każdy fragment koralowca w sterylnym pojemniku o pojemności 250−500 mL z nakrętką zawierającą sterylny roztwór soli fizjologicznej.
   4. W laboratorium, używając sterylnych kleszczy i szczypiec, waż 5 g fragmentów koralowców za pomocą sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm na wadze.
   5. Przelej 5 g próbki koralowca do sterylnego moździerza i rozmasakruj ją sterylnym tłuczkiem.
   6. Za pomocą sterylnej łopatki przenieś próbkę macerowanego do kolby z 45 mL 3% roztworu NaCl oraz 10−15 szklanych kulek o średnicy 5 mm. Użyj 45 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej do przemycia zaprawy i odzyskania maksymalnej ilości macerianu.
   7. Utrzymuj kolby w stałym mieszaniu (150 x g) przez 16 godzin przy temperaturze wody w miejscu pobierania próbek.
      NUTA: Dla koralowców płytkowodnych optymalna temperatura wynosi 24−28 °C. Ten etap odłącza mikroorganizmy od różnych przedziałów koralowców, takich jak te przymocowane do komórek gospodarza lub te żyjące wewnątrz tkanki i szkieletu. Po tym kroku maceracje koralowców nie powinny być przechowywane, a etap izolacji należy wykonać natychmiast.

2. Izolacja bakterii degradujących ropę z wody morskiej i/lub koralowców

1. Przygotuj minimalne medium zawierające frakcję rozpuszczalną w wodzie w oleju (oWSF) oraz frakcję nierozpuszczalną w wodzie oleju (oWIF) jako jedyne źródło węgla.
   1. Dodaj 1−2% ropy naftowej do 500 ml sterylnej wody destylowanej. Użyj kolby filtracyjnej otwartej na dnie, aby usunąć frakcję rozpuszczalną bez naruszania górnej warstwy nierozpuszczalnej frakcji.
   2. Utrzymuj mieszankę w stałym mieszaniu w temperaturze 24−28 °C przy 150 x g przez 48 godzin.
   3. Umieść kolbę filtrującą zawierającą frakcje ropy naftowej na stabilnej powierzchni i odczekaj 10−20 minut, aby umożliwić oddzielenie frakcji rozpuszczalnej od nierozpuszczalnej.
   4. Przelej oWSF do nowej sterylnej kolby, oszczędzając oWIF przez otwarcie dolnego kolby filtrującej i wyjmowanie rozpuszczalnej frakcji.
   5. Wykorzystując cały oWSF odzyskany w poprzednim etapie (~400 mL), przygotuj 1 L minimalnego medium agarowego BH (Bushnell Haas) zawierającego oWSF jako jedyne źródło węgla.
   6. Korzystając z oWIF pozostałego w kolbie z etapu 2.1.4, przygotuj 1 L minimalnego medium z agaru BH zawierającego oWIF jako jedyne źródło węgla.
2. Wyizoluj bakterie degradujące oWSF i oWIF.
   1. Używając wody i macerianu koralowca z kroków 1.1.2 i 1.2.7, odpowiednio rozcieńcz próbki do ^10-6 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, jak poniżej.
3. Przeprowadzaj seryjne rozcieńczenia do ^10-9 w bezpłodnym roztworze soli fizjologicznej dla próbek koralowców oraz do ^10-6 dla próbek wody. Pipeta rozcieńcza się 5 razy w górę i w dół, zanim wyrzuci końcówkę. Vortex pobiera próbki przez 5 sekund za każdym razem przed kolejnym rozcieńczeniem seryjnym.
4. Pipeta 100 μL każdego rozcieńczenia na szalkach Petriego zawierających media agarowe BH-oWSF i BH-oWIF i nałóż je na płytkę.
5. Inkubuj płytki przez 1−3 dni w docelowej temperaturze (np. 26 °C). Sprawdzam tablice raz dziennie.
6. Wybieraj i izoluj kolonie o wyraźnych morfologiach wzrostu na nowych płytkach za pomocą techniki płyt spaskowanych. Powtarzaj ten krok tyle razy, ile trzeba, aby na talerzach rosły czyste kolonie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Butelka do przechowywania mediów PYREX o pojemności 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1743E20/1395-500	Używana do pobierania próbek wody.
Butelki aspiratorowe 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Używa się do rozdzielania frakcji oleju.
Szczypce do cięcia drutu o średnicy 6 cali	Thomas Scientific/Restek	1173Y64/23033	Używa się do cięcia fragmentów koralowców.
Agar	Himedia	PCT0901-1KG	Używano go do produkcji materiałów stałych.
Bulion Bushnell Haas	Himedia	M350-500G	Używane jako minimalne medium uzupełniane o źródła węgla.
Kolba Erlenmeyera	Thomas Scientific/DWK Life Sciences (Kimble)	4882H35/26500-125	Używa się do inkubacji maceratu koralowcowego za pomocą szklanych koralików.
Maska laminarna			Musiał pracować w warunkach sterylnych.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)	Himedia	M1245-1KG	Wykorzystywany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)	Himedia	M384-500G	Wykorzystywany jako bogate podłoże do hodowli bakterii.
Inkubator Orbital-Shaker			Używa się do inkubacji płynnego medium i oleju.
Inkubator Płyt			Używana do inkubacji płyt.
Porcelanowy moździerzz i tłuczek	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Używany do rozdrabniania fragmentów koralowców.
Chłodzenie w wirówce			Używany do wirowania hodowli bakteryjnych.
Spektrofotometr			Używany do pomiaru gęstości optycznej hodowli bakteryjnych.
Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard	Promega	A1120	Stosowane do ekstrakcji DNA przez szczepy mikrobiologiczne.