Śledzenie wzrostu bakterii z rozdzielczością pojedynczych komórek w układzie mikrofluidowym

Streszczenie

Źródło: Cabeen, M. T. i in. Analiza mikrofluidyczna pojedynczych komórek Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

Film pokazuje użycie urządzenia mikrofluidycznego do obserwacji wzrostu bakterii na poziomie pojedynczych komórek. Pokazuje, jak nieruchome komórki bakteryjne, zamknięte w mikroskalowych rowach, są nieustannie odżywiane i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym. System ten umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym podziału komórek i śledzenia linii genealogicznej na przestrzeni wielu pokoleń.

Protokół

1. Odlewanie urządzeń PDMS

1. W środowisku wolnym od pyłu mieszać polimer polidimetylosiloksanu (PDMS) z środkiem utwardzającym w proporcji 10:1 i odgazować pod próżnią przez co najmniej 10 minut.
2. Umieść silikonowy master (lub jego replikę z epoksydu lub poliuretanu) na kawałku nieuszkodzonej folii aluminiowej na polistyrenowej płycie Petriego. Wylej odgazowaną mieszankę PDMS na głąb do głębokości około 5 mm. Odgazuj płytę Petriego przez co najmniej 10 minut. Użyj delikatnego strumienia powietrza, aby rozbić pęcherzyki na powierzchni.
   NUTA: Plastikowa replika mastera może częściowo unosić się podczas odgazowywania powietrza; Jeśli tak się stanie, naciśnij replikę czystą plastikową aplikatorką.
3. Utwardzaj PDMS przez co najmniej godzinę w piekarniku w 60 °C i ostyguj do temperatury pokojowej. Usuń folię aluminiową zawierającą master i utwardzony PDMS z płyty Petriego. Ostrożnie zdejmij folię aluminiową z tyłu mastera, a następnie ostrożnie zdejmij PDMS z mastera.
   NUTA: Alternatywnie, PDMS można utwardzać przez noc w temperaturze pokojowej. Względną kruchość płytki krzemowej można zniwelować, stosując klej epoksydowy do trwałego połączenia płytki z aluminiowym tarczą o grubości 1/16 cala o tym samym rozmiarze co płytka.
4. Ponieważ płytka zazwyczaj zawiera kilka urządzeń mikrofluidycznych o nieco różnych wymiarach, należy przytnąć pojedyncze urządzenie na odpowiedni rozmiar za pomocą czystego, ostrego skalpela.
   NUTA: Do rutynowej pracy z Bacillus subtilis używaj urządzeń z rowami komórkowymi o szerokości 1,0 μm.

2. Dziurkowanie i łączenie urządzeń

1. Nałóż kawałek przezroczystej taśmy biurowej (patrz Tabela materiałów) na wzorzystą stronę urządzenia, aby zwiększyć widoczność wzorzystych elementów. Kanały wlotowe i wylotowe są oznaczone jako obszary okrągłe na przeciwległych końcach widocznych kanałów płynowych (Rysunek 1). Aby poprawić ich widoczność podczas wybijania otworów w urządzeniu na piny wlotów i wylotów, oznacz wloty i wyjścia kropkami za pomocą drobnego markera.
   NUTA: Aby zapewnić, że piny wlotowe i wyjściowe nie są zatłoczone, każdy drugi kanał jest przebijany, zaczynając od kanału tuż pod alfabetycznym oznaczeniem urządzenia.
2. Odwróć urządzenie PDMS tak, aby strona wzorowana była w dół, i przebij urządzenie do oznaczonych kropek za pomocą wycinaka biopsyjnego o średnicy 0,75 mm; Porzuć ciosy.
   NUTA: Urządzenia są dziurkane z wzorzystym kierunkiem w dół, ponieważ otwór powstały podczas wyciskania biopsji jest zazwyczaj lekko rozszerzony tam, gdzie dziurpak wchodzi do polimeru. Dziurkowanie urządzenia w odwróconej orientacji zapewnia, że otwór po stronie wzorzystej ma ostrą brzegę.
3. Za pomocą stereomikroskopu upewnij się, że otwory zachodzą na siebie z wlotem i wylotem urządzenia. Użyj cienko końcówkowanych pęset, aby usunąć zbędne fragmenty PDMS z dziurkowanych otworów.
4. Użyj taśmy klejącej, aby usunąć kurz z obu stron urządzenia i umieść je w czystej płytce Petriego z polistyrenu. Przygotuj szkło pokrywkowe o wymiarach 22 mm x 40 mm, zwilżając alkoholem 100% izopropylowym i przetrzeć chusteczką do czyszczenia pomieszczenia; wysusz strumieniem powietrza bez kurzu lub azotu.
5. Umieść funkcję urządzenia PDMS z wybitym elementem do góry razem z wyczyszczoną szybą pokrywy w środku do czyszczenia plazmy tlenowej.
   1. Plazma – urządzenie jest stosowane w następujących ustawieniach: próżnia, 70 mTorr; Ciśnienie O₂, 200 mTorr; czas trwania, 15 sekund; mocy, 30 W. Bezpośrednio po zakończeniu okresu obróbki plazmy usuń urządzenie i zakryj szkło z oczyszczacza plazmowego.
   2. Odwróć PDMS i umieść go na środku szkła osłonowego tak, aby wzór stykał się ze szkłem; upewnij się, że kanały zasilające (biegnące między wlotem a wylotem) są wyrównane z długą osią szkła pokrywowego. Naciśnij bardzo delikatnie, aby upewnić się, że PDMS uszczelnia się na szybie.
6. Piecz złożony sprzęt w piecu przez co najmniej godzinę w 60 °C. Po wypieczeniu ręcznie sprawdź, czy PDMS jest połączony ze szkłem, delikatnie naciskając na jeden róg urządzenia.
   NUTA: Po związaniu urządzenia należy użyć w ciągu 24 godzin, ponieważ polimer staje się coraz bardziej hydrofobowy po okresie po osadzeniu.

3. Przygotowanie instalacji hydraulicznych w mikrofluidyce

1. Przycinam długości rurek polimerowych (średnica wewnętrzna (ID) 0,02 cala, zewnętrzna średnica (OD) 0,06 cala) na odpowiednie długości, aby sięgnąć od pompy strzykawkowej do aparatu przełączającego (jeśli jest używane) oraz urządzenia po zamontowaniu na mikroskopie. Tnij tyle odcinków, ile jest mikrofluidycznych ścieżek.
2. Złącza Y do zaworów zaciskowych (jeśli używasz) zmontuj przez przycięcie i przymocowanie 2 cm elastycznych silikonowych rurek (średnica 0,03 cala, średnica 0,065 cala) do górnych kolców "Y" oraz 1 cm rurek silikonowych do dolnego kolca "Y".
3. Wytnij 10 cm (lub odpowiednie) odcinki rur polimerowych; Łączą je na jednym końcu z łącznikiem przełącznika, wkładając je w silikonowe segmenty rury o średnicy 1 cm na dolnym kolcu litery "Y". Podłącz je na drugim końcu do igieł 21G, które zostały wyjęte z plastikowych adapterów strzykawek i wygięte pod kątem około 90° od końca igły.
4. Podłącz 21G igły do jednego końca segmentów rurki, które będą prowadzić od strzykawek do urządzenia przełącznikowego, wprowadzając igły do rurki. Inne końce każdej długości rurki włóż w silikonowe segmenty rurki na kolcach wlotowych złączy Y.
   NUTA: Użyj jakiegoś urządzenia, które przytrzyma zawory zaciskowe i złącza na miejscu; można go łatwo wykonać z pudełka z końcówką mikropipety (Rysunek 2D).
5. Przytnij odcinki rurek polimerowych, aby przenosić odpady z wylotu urządzenia do zlewki odpadów. Połącz je na jednym końcu z wygiętymi drutami 21-G przygotowanymi zgodnie z opisaniem powyżej. Oklej drugi koniec rurek do zlewki na odpady.
6. Przygotuj odpowiednie ilości podłoża zawierającego 0,1 mg/mL surowicowej albuminy (BSA) i napełnij pożądany rozmiar oraz liczbę strzykawek. Podłącz strzykawki z BSA do przygotowanych igieł 21G podłączonych do rurki wlotowej i załaduje je do pomp strzykawkowych.
   NUTA: W typowych eksperymentach używa się 5 kanałów urządzenia, każdy z 20 mL strzykawką. Eksperyment, w którym nośnik jest zamieniany, wymaga 2 banków po 5 strzykawek każdy. Tutaj pompa zawierająca pierwszy bank nazywana jest pompą fazy 1, a pompa zawierająca drugi bank wraz z medium po przełączniku nazywana jest pompą fazy 2.
7. Płucz powietrze z wlotów, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużym przepływem (>500 μL/min), zaczynając od pionowego ustawienia pomp i stukania w strzykawki, aby wydobyć pęcherzyki powietrza na powierzchnię. Po wypłukaniu powietrza ze strzykawek ustaw pompę poziomą i stopniowo stukaj lub przesuwaj polimerowe linie ze strzykawek przez urządzenie przełącznikowe, aby usunąć i wypłukać pęcherzyki powietrza. Powtórz ten proces dla drugiego banku strzykawek (jeśli zmieniasz medium).
8. Po oczyszczeniu pęcherzyków powietrza ustaw pompę strzykawkową fazy 2 (czyli z medium użytym po zmianie) na 1,5 μL/min, a następnie wstrzymaj przepływ. Przyłóż małe spinki spoiowe na segmentach elastycznej rurki na gałęzi złączy Y odpowiadających drugiej fazie średniej. Kontynuuj pracę pompy strzykawkowej fazy 1 z umiarkowanym przepływem (np. 10 μL/min) przez co najmniej 30 minut, aby opłukać drugie medium z rury wlotowej poniżej złącza Y.

4. Przygotowanie hodowli komórkowej

1. Uprawiaj prehodowlę interesującego szczepu w pożądanym podłożu przez noc, aż do fazy stacjonarnej. Szczep bakteryjny powinien zawierać mutację, która unieruchomi komórki, aby komórki nie wypływały z kanałów urządzenia.
   NUTA: W tym protokole szczep bakteryjny to B. subtilis 3610 zawierający podstawienie hagA233V (mutacja ta powoduje, że wicień jest prosta zamiast spiralna, co uniemożliwia ruchliwość komórek), raportator PrsbV-mNeonGreen dla stresu komórkowego oraz konstytutywny raportator Phyperspank-mNeptune (czerwony) do podświetlania komórek. W przykładowym protokole używa się medium Lennox Luria-Bertani (LB). Typowe szczepy w eksperymentach mikrofluidycznych zawierają jeden lub więcej fluorescencyjnych raportatorów transkrypcyjnych oraz konstytutywnie produkowane, cytoplazmatyczne białko fluorescencyjne, co ułatwia automatyczne wykrywanie komórek. Nie zaobserwowano defektów wzrostu przy użyciu medium bogatego w LB Lennox, ale wzrost B. subtilis w minimalnych ośrodkach może być hamowany w warunkach mikrofluidycznych, ponieważ wydzielane siderofory są wypłukiwane przez przepływ medium. W takich warunkach wzrost może zostać przywrócony przez dodanie cytrynianu sodu i chlorku żelaza do podłoża, jak zgłoszono dla podłoża S750.
2. Rano w dniu eksperymentu rozcieńcz komórki B. subtilis 1:50 do przegrodzonego kolbki o pojemności 250 mL zawierającej 25 mL medium wzrostowego. Hodować komórki przez 5–6 godzin w potrząsającej kulturze w temperaturze 37 °C do gęstości optycznej większej niż 1.
   NUTA: Gęsta hodowla komórkowa jest preferowana, ponieważ komórki B . subtilis w fazie stacjonarnej są mniejsze i rzadziej występują w łańcuchach komórkowych, co ułatwia ładowanie urządzeń. Różne gatunki bakterii mogą wymagać innych podłoży lub warunków wzrostu, aby zapewnić optymalne obciążenie.
3. Używając strzykawki wyposażonej w filtr o rozmiarze poru 5 μm, przefiltruj około 15 mL hodowli komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 mL, aby usunąć łańcuchy komórkowe B. subtilis (jest to niepotrzebne dla E. coli i może nie być konieczne w przypadku innych gatunków).
   NUTA: Stosunkowo niewiele komórek powinno być usuniętych; Filtrat powinien być mętny.
4. Filtrowaną kulturę wiruj przez 10 minut w 4000 x g w temperaturze pokojowej. Wylej supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w pozostałej płynie supernatantu w tubie, dodając około 500 μL świeżego medium, jeśli to konieczne, aby ułatwić pipetowanie zawiesiny komórkowej.

5. Ładowanie urządzeń

1. Delikatnie umieść puste, cienkie końcówki mikropipety z żelem (patrz Tabela materiałów) do otworów wylotowych urządzenia mikrofluidycznego.
2. Używając cienkich końcówek do załadunku żelowego z mikropipetą P200, pasywuj urządzenie, wstrzykując medium zawierające 1 mg/mL BSA do otworów wlotowych, obserwując końcówki w otworach wylotowych, aby monitorować wypełnianie kanałów mikrofluidycznych (Rysunek 2A). Inkubuj urządzenie w temperaturze pokojowej przez około 5 minut.
   NUTA: BSA jest powszechnie stosowany jako środek blokujący lub pasywujący, który wiąże się z hydrofobową powierzchnią polimeru PDMS, zwiększając jego hydrofilowość i zmniejszając wiązanie innych białek lub komórek (poprzez cząsteczki powierzchni komórki).
3. Używając cienkich końcówek do ładowania żelu, załaduj każdy kanał ogniwami zawieszonymi (z sekcji 4), używając końcówek w kanale wylotowym do monitorowania postępu komórek przez urządzenie (Rysunek 2B).
   NUTA: Ładowanie ułatwia się ustawienie mikropipety P200 do maksymalnej objętości 200 μL, a następnie zasysanie poduszki powietrza przed zasysnięciem niewielkiej objętości (około połowy objętości cienkiego przekroju końcówki pipety) komórek. Objętość komórek zawieszonych nie musi być precyzyjna, ponieważ objętość urządzenia PDMS jest niewielka w porównaniu do mikropipety. Nie znamy górnej granicy gęstości komórek zawieszonych ponownie, o ile zawiesina komórkowa może być podłączona pipetą do urządzenia. Grudki komórek mogą zatkać urządzenie i należy ich unikać poprzez dokładne pipetowanie i/lub mieszanie wirów.
4. Delikatnie wyjmij końcówki z żelowymi końcówkami z otworów wylotowych, pracując pojedynczo, aby zapobiec uszkodzeniu urządzenia.
5. Wiruj urządzenie w mikrowirówce stołowej w odpowiednim adapterze wirnikowym w ilości około 6 000 x g przez 10 minut (rysunek 2C).
   NUTA: Zastosowano specjalnie obrabiany aluminiowy adapter wirnika, zaprojektowany do mikrowirówki (rysunek 2C); Różne modele wirówek mogą być używane z odpowiednimi adapterami wirnikowymi. Ważną cechą adaptera jest to, że wywiera on siłę boczną w kierunku zamkniętych końców rowów komórkowych, co wymusza wejście komórek do kanałów bocznych.
6. Sprawdź pomyślne załadowanie pod mikroskopem (rysunek 3), ale bez przymocowania urządzenia do uchwytu szkiełka lub wkładki scenicznej.
   NUTA: W tym protokole do weryfikacji na tym etapie oraz do późniejszego obrazowania używa się obiektywu zanurzającego w oleju 60X, 1,4 NA Ph3.

6. Montaż, wyważenie i montaż urządzenia

1. Ostrożnie zamontuj załadowane urządzenie na wkładce sceny, przyklejając szyby osłony po obu stronach PDMS do dolnej części wkładki scenicznej (czyli odwróć wkładkę sceniczną przed przymocowaniem urządzenia). Odwróć zespół wkładki sceny tak, aby PDMS był skierowany do góry i umieść go na miękkiej powierzchni, takiej jak bezkurzowa chusteczka (rysunek 2D).
2. Reguluj przepływ pompy strzykawkowej fazy 1 do 35 μL/min. Pracując z jednym torem na raz, włóż igłę wlotową, a następnie igłę wylotową (czyli prowadząc do zlewki odpadowej; Rysunek 2E).
3. Usuń nadmiar medium czystą, bezkurzną chusteczką i sprawdź urządzenie pod kątem wycieków. Sprawdź rurkę wylotową pod kątem obecności nadmiaru komórek (zwykle wyglądających jak mętny pasek) oraz środkowej łąkotki, która powoli przesuwa się w stronę zlewki odpadowej.
4. Pozwól urządzeniu pracować z prędkością 35 μL/min przez około 15–30 minut, aż wszystkie podłączone tory będą odprowadzać wody do zlewki odpadów.
5. Ustaw pompę strzykawkową fazy 1 na 1,5 μL/min i zatrzymaj przepływ. Całą pompę i urządzenie należy poddać mikroskopowi (proces ten ułatwia umieszczenie wszystkiego na wózku na kółkach) i ponownie uruchomić przepływ medium fazy 1 z prędkością 1,5 μL/min. Ostrożnie zamontuj wkład sceniczny wraz z urządzeniem na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym, używając taśmy w razie potrzeby do prowadzenia rurki wlotowej i wyjściowej.
6. Zlokalizuj pożądane pozycje na urządzeniu do obrazowania i rozpocznij obrazowanie zgodnie z oczekiwaniami. Należy zauważyć, że komórki zazwyczaj potrzebują kilku godzin (około 10 pokoleń), aby osiągnąć ustalony wzrost fazy wykładniczej, a początek akwizycji obrazu może być opóźniony w zależności od potrzeb, aby obrazowanie rozpoczęło się po okresie równowagi.
   NUTA: Wzrost komórek w stanie ustalonym w fazie wykładniczej powinien być weryfikowany podczas kolejnej analizy obrazów poprzez śledzenie czasów podziału komórek i upewnienie się, że osiągnęły stałą wartość minimalną.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat urządzenia mikrofluidycznego. Schemat urządzenia pokazano mniej więcej w skali. Oznaczenie alfabetyczne jest oznaczone wraz ze strefami wlotu i wylotu, które są wybite, aby połączyć igły z końcem. Zazwyczaj używa się poło...

Materiały