$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Warunki hodowli bakteryjnej
- Pracując pod laminarnym kapturem przepływowym, użyj 100 μL zapasu glicerolowego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) oznaczonego tagiem Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, przechowywany w temperaturze -80 °C) do inokulacji 5 mL medium Luria-Bertani (LB). Inkubuj w temperaturze 30 °C, potrząsając przy 250 obr./min przez noc.
- Następnego dnia ponownie zawiesz 100 μL nocnej hodowli w podłożu LB 5 mL i inkubuj w tych samych warunkach przez 5 godzin (faza wykładnicza). Próbkę 1 mL aliquot należy do probówki 2 mL, pozwól do ostygnięcia do temperatury pokojowej (~15 min) i włóż w wirówkę (2300 x g przez 5 minut).
- Usuń supernatant i dodaj 1 ml bufora ruchliwości do pelletu. Krótko przewij, aby ujednolicić próbkę. Rozcieńcz, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek, np. 5 x 105 mL-1.
- Do eksperymentów z udziałem naturalnych społeczności, takich jak te pochodzące ze strumieni, przygotuj nieselektywny podłoże uprawy. Na przykład użyj sterylnie filtrowanej i autoklawowanej wody strumieniowej lub sztucznego medium wodnego wzbogaconego o złożone źródło węgla (medium LB).
2. Przygotowanie urządzenia mikrofluidycznego w polidimetylosiloksanie (PDMS)
- Zaprojektuj pożądaną porowatą geometrię za pomocą oprogramowania do wspomagania rysunku komputerowego (CAD), które składa się z macierzy okręgów (czyli nieprzepuszczalnej przeszkody przepływu), opisanej przez rozmiar promienia i współrzędne środkowe.
UWAGA: Przykład porowatej geometrii o losowych rozmiarach ziaren i porów przedstawiono na Rysunku 1A. Kanał obserwacyjny bez przeszkód w pobliżu wyjścia ułatwia pozyskiwanie krzywych przełomowych (BTC). - Na podstawie wybranej geometrii przygotuj formę przy użyciu standardowej fotolitografii SU-8.
UWAGA: Alternatywnie, formy można zamówić także w dedykowanym zakładzie mikrofabrykacji. Aby uzyskać niejednorodny przepływ płynów w płaszczyźnie poziomej, ważne jest zaprojektowanie grubości komory mikrofluidycznej o rzędzie wielkości średniej wielkości poru gardła. Jednak upewnij się, że wymiary urządzenia mikrofluidycznego są odpowiednie do obserwacji pod mikroskopem (np. do pracy na preparatach mikroskopowych). - Przygotuj 50 g PDMS, dodając 10% splotu (kopolimer dimetylowodrówodorowy) do 90% elastomera pod względem wagi, używając strzykawki bez igły. Pracuj w czystych warunkach i unikaj kurzu tak bardzo, jak to możliwe. Wymieszaj oba odczynniki w czystym, jednorazowym pojemniku i przystosuj próżnię (100 mbar) przez 30 minut, aby usunąć rozpuszczone powietrze i pęcherzyki z lepkich PDMS.
- Włóż formę do szalki Petriego (100 mm średnicy, 15 mm wysokości). Wylej PDMS na formę do pożądanej wysokości (np. 2-5 mm). Przykryj szalkę Petriego i trzymaj ją w 60 °C przez 4 godziny (przez noc dla grubszych warstw), aby się utwardziła.
UWAGA: Dla celów wizualizacyjnych światło powinno być w stanie przechodzić przez PDMS; dlatego pożądana jest cienka warstwa o grubości od 2 mm do 5 mm. Grubsze warstwy (>5 mm) zmniejszają przezroczystość urządzenia, a cieńsze są narażone na odkształcenia podczas aplikacji. - Wyjmij formę z piekarnika i pozwól urządzeniu mikrofluidycznemu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po ostygnięciu ostrożnie usuń pożądaną część PDMS skalpelem.
UWAGA: Silne naciski na formę powodują pęknięcia formy. Nie dotykaj PDMS gołymi rękami, ponieważ odciski palców wpływają na przezroczystość optyczną. - Tymczasowo zabezpiecz dno kanału PDMS (gdzie wygrawerowano pożądaną geometrię) taśmą. Za pomocą wyciskacza do biopsji o średnicy 0,5 mm przebij kanał mikrofluidyczny, tworząc wlot i wylot dopasowany do rury o średnicy wewnętrznej 0,5 mm.
UWAGA: Miękkość PDMS zapewni szczelność po włożeniu rurki. Kanały wlotowe i wylotowe nie mogą być wykonane po uszczelnieniu PDMS do szyby. - Uszczelnij kanał mikrofluidyczny za pomocą wiązania plazmowego tlenu za pomocą generatora wysokiej częstotliwości (wiążącego plazmę, Tabela materiałów). W tym celu wyczyść szkiełko z krzemianem (25 mm x 75 mm) etanolem i pozwól mu wyschnąć. Usuń taśmę z kanału PDMS i umieść kanał tak, że porowata strona jest skierowana do góry. Traktuj szkiełka krzemianowego i powierzchnie PDMS plazmą przez około 45 sekund w temperaturze pokojowej.
- Umieść kanał PDMS na szkiełku z krzemianowego szkła i podgrzej go w temperaturze 100 °C przez 30 minut na płycie grzewczej.
- Wyjmij urządzenie mikrofluidyczne z płyty grzewczej i schłodzi je do temperatury pokojowej. Podłącz wlot kanału PDMS z rurką. Zastosuj próżnię na 30 minut, aby usunąć powietrze z PDMS, które jest prawie nieprzepuszczalne dla cieczy, ale przepuszczalne dla gazu.
- Przygotuj 100 mL buforu ruchliwości (10 mM fosforanu potasu, 0,1 mM etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA), uzupełniony 1% glukozy całowo-w/v, pH 7,0) i wstrzyknij 1 ml tego do urządzenia mikrofluidycznego za pomocą pompy strzykawkowej pracującej przy 10 μL min-1.
UWAGA: Ponieważ PDMS jest niedosycony gazem (z powodu poprzedniego etapu próżni), pęcherzyki znikną w ciągu ~30 minut.
3. Analizuj transport bakterii za pomocą mikrofluidycznych urządzeń PDMS
- Umieść mikrofluidyczne urządzenie PDMS, wcześniej nasycone buforem ruchliwości, na etapie mikroskopu. Użyj taśmy, aby przymocować rurkę, aby zminimalizować zakłócenia przepływu podczas ruchu sceny.
- Przesuń stopień mikroskopu do kanału obserwacyjnego blisko wylotu. Za pomocą mikroskopii jasnego pola lub kontrastu fazowego skup się na środku kanału obserwacyjnego i reguluj powiększenie, aby zobaczyć poszczególne komórki bakteryjne.
- Zmień ustawienia ścieżki światła na mikroskopię fluorescencyjną i dostosuj czas naświetlenia kamery, aby rozróżnić pojedyncze komórki bakteryjne (np. 100 ms), lub tak, aby sygnały fluorescencji komórek były co najmniej 3 razy silniejsze niż szum tła.
- Następnie włóż rurkę wlotową do rurki o pojemności 2 mL zawierającej zawiesinę bakteryjną. Odwróć kierunek pompy i zacznij wycofywać zawieszenie z przepływem 1 μL min-1.
- Skanuj przekrój całego kanału obserwacyjnego, rejestrując zdjęcie złożone co 2 minuty, przez cały czas trwania eksperymentu.
