Ciągłe monitorowanie szumu biologicznego u bakterii za pomocą mikroskopii poklatkowej

Streszczenie

Źródło: Chaimovitz, E. A. i inni. Ciągłe pomiary szumu biologicznego w Escherichia coli za pomocą mikroskopii poklatkowej. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje wizualizację w czasie rzeczywistym biologicznego szumu u E. coli poprzez śledzenie fluktuacji fluorescencji GFP podczas wzrostu i podziału bakterii za pomocą mikroskopii poklatkowej.

Protokół

1. Przygotowanie próbki do obrazowania mikroskopowego
   1. Wyjmij kolbę z kąpieli wodnej. Wytrzyj zewnętrzną część kolby i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej (25 °C).
      NUTA: Zdejmuj kolbkę około 3 minuty przed końcem timera.
   2. Wlewaj 3 mL żelu na obwód płyty w ruchu okrężnym. Zostaw na kilka minut do zastygnięcia.
   3. Zamknąć płytki taśmą i przebić kilka otworów igłą 25 G. Przewróć wszystkie naczynia, aby zapobiec skrapaniej wody na żelu.
   4. Wszystkie naczynia inkubuj w temperaturze 4 °C przez 30 minut, aby umożliwić pełne utwardzenie i zapobiec mitozie komórek.
      NUTA: Próbki pozostawiać w temperaturze 4 °C do kolejnych pomiarów, nie dłużej niż jeden dzień.
   5. Uruchom mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta.
   6. Znajdź początkową ostrość za pomocą obiektywu o najniższym wzmocnieniu i włącz automatyczny system ostrości (AFS).
   7. Jeśli trzeba, użyj oleju, zalej obiektyw olejem i ostrożnie rozprowadzaj płytkę, poruszając płytką kontrolerem platformowym (nie ręcznie), a AFS można ponownie włączyć.
   8. Użyj względnego przekroju w kierunku Z, stosując domyślną sugestię dla przekrojów krokowych Z.
      NUTA: Rób zdjęcia w jasnym polu co 5 minut i fluorescencyjne co 20 minut. Czasem trzeba dostosować ostrość w ciągu pierwszych 30 minut. Podgrzewanie skrzynki inkubatora mikroskopu i oleju podczas chłodzenia próbki pomaga zmniejszyć początkową utratę ostrości.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szklana antena 35mm	Mattek	P35G-0.170-14-C	Grubość odpowiadająca soczewce mikroskopu.
Agarozy	Lonza	5004	Przygotowanie LB
Eclipse Ti	Nikon		Mikroskop odwrócony
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Olej immersyjny
Taśma parafilmowa	Bemis	PM-996	W tekście nazywane taśmą