Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Protokół

1. Przygotowanie Biblioteki Metagenomowej z systemem przesiewu enzymów genetycznych do wykrywania p-nitrofenolu (pNP) (pNP-GESS)
   1. Skonstruuj bibliotekę metagenomową w Escherichia coli z wektorem fosmidowym, korzystając z zestawu do produkcji biblioteki fosmidów.
   2. Aliquot 100 μl biblioteki do przechowywania w temperaturze −70 °C, która jest źródłem komórek biblioteki metagenomowej.
      NUTA: Gęstość optyczna próbki mierzonej na długości fali 600 nm (OD₆₀₀) tego zbioru bibliotecznego wynosi około 100.
   3. Rozmroź 100 μl biblioteki metagenomicznej stocku na lodzie i inokuluj w kolbie 500 ml zawierającej 50 ml Luria-Bertani (LB) i 12,5 μg/ml chloramfenikolu, a następnie inkubuj w 37 °C przez 2 godziny.
   4. Komórki pobieraj w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez wirowanie w 1000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Szybko ponownie zawiesz pellet w 50 ml lodowato zimnej wody destylowanej (DW) i ponownie wiruj w 1000 x g przez 20 minut w 4 °C.
   6. Ponownie zawiesić pellet w 50 μl lodowato zimnej masy DW z 10% glicerolem. Do elektroporacji użyj 50 μl tej komórki aliquot.
   7. Umieść mieszaninę elektrokompetentnych ogniw 50 μl i pGESS(E135K) DNA (100ng) w lodowatej elektroporacyjnej cuwette i elektroporacji (1,8 kV/cm, 25 μF) w mieszaninie.
   8. Szybko dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z medium katabolitowym (SOC) i delikatnie zawiesz komórki.
   9. Przełóż komórki do rurki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml za pomocą pipety i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   10. Rozłóż 500 μl odzyskanych komórek na płytkę LB o wymiarach 20 x 20 cm kwadratowych zawierającą 12,5 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml ampicyliny. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.
   11. Zeskrobaj kolonie za pomocą skrobaka do komórek i zbieraj komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 ml, używając nośnika do przechowywania lodowatych komórek.
   12. Wirować w 1000 x g przez 20 minut w 4 °C. Ponownie zawiesić pellet w 10 ml nośniku chłodzonego na lodowate komórki, aby uzyskać przedawkowanie₆₀₀ na 100.
   13. Zachowaj 20 μl komórek do przechowywania w temperaturze −70 °C.
        
2. Usuwanie fałszywych alarmów z biblioteki metagenomicznej
   1. Rozmrozić komórki biblioteki metagenomowej (od etapu 1.13) zawierające metagenomowe DNA fosmid i pGESS (E135K) na lodzie.
   2. Zainokuluj 10 μl komórek w 2 ml LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w 14-ml probówce z okrągłym dnem. Inkubuj w 37 °C z potrząsaniem przy 200 obr./min przez 4 godziny.
   3. Tymczasem włącz maszynę do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i otwórz domyślne oprogramowanie FACS. Użyj następujących ustawień: średnica końcówki dyszy 70 μm; Czułość na powierzchnię rozpraszania w przód (FSC-A), wzmocnienie 300 V-logarytmicznych; Czułość na obszar rozpraszania bocznego (SSC-A), amplifikacja V-logarytmiczna 350; wrażliwość na obszar izotiocyanianu fluoresceiny (FITC-A), amplifikacja V-logarytmiczna 450; parametr progowy, wartość FSC-A 5.
      NUTA: Typowe ustawienia są podane dla urządzeń FACS wymienionych w Tabeli Materiałów. Dostosuj ustawienia dla innych urządzeń FACS.
   4. Rozcieńcz komórki biblioteki metagenomowej od etapu 2.2, dodając 5 μl próbki do 5-ml probówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
   5. Umieść rozcieńczoną próbkę biblioteki na porcie ładowania instrumentu FACS i kliknij przycisk Load na panelu Acquisition w oprogramowaniu FACS.
   6. Dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 1 500 zdarzeń/sek, klikając i sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   7. Utwórz wykres rozrzutowy FSC-A skalowany według logów w porównaniu do SSC-A skalowanego logarytmem na globalnym arkuszu, klikając przycisk Dot Plot w pasku narzędzi. Dostosuj bramkę rozproszoną R1, aby obejmowała zdarzenia singletów (populację bakterii) za pomocą przycisku Brama Wielokątna na pasku narzędzi.
   8. Narysuj histogram z liczbą komórek w porównaniu do logarytmicznie skalowanego FITC-A na arkuszu, klikając przycisk Histogram. Następnie dostosuj napięcie FITC z zakładki Ustawienia cytometru w oknie Kontroli Inspektora tak, aby szczyt rozkładu w kształcie dzwonu był mniejszy niż 10² FITC-A.
   9. Stwórz skalowanie loga FSC-A vs. wykres log FITC-A poprzez kliknięcie przycisku Dot Plot w globalnym arkuszu. Ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Brama Wielokąta na pasku narzędzi, tak aby bramka znajdowała się pomiędzy +5% a -5% komórek od środka rozkładu (łącznie 10% komórek wokół szczytu krzywej dzwonowej).
   10. Umieść probówkę zawierającą 1,2 ml LB zawierającą 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu na wyjściu z instrumentu FACS i wyodrębnij 10 do⁶ komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
   11. Zdejmij probówkę, korek i delikatnie wyjmij wir.
        
3. Przesiewowe badania enzymów metagenomowych
   1. Inkubuj posortowane komórki (od etapu 2.11) w temperaturze 37 °C, potrząsając z prędkością 200 obr./min, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,5.
   2. Dodaj 1 μl roztworu indukcji kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidów. Inkubuj komórki przez dodatkowe 3 godziny w 37 °C z potrząsania przy 250 obr./min.
   3. Aby przygotować komórki do sortowania, dodaj 0,5 ml hodowanych komórek i odpowiedni substrat (p-nitrofenyloctan, p-nitrofenyl-β-D-celobiosyd lub fenylfosforan) do 14-ml rurki z okrągłym dnem przy końcowym stężeniu 100 μM.
      1. Do próbki kontrolnej dodaj 0,5 ml hodowli komórek z etapu 3.2 do probówki o pojemności 14 ml z okrągłym dnem. Dodaj taką samą objętość PBS jak objętość podłoża w kroku 3.3.
   4. Inkubuj obie próbki w temperaturze 37 °C z potrząsania przy 200 obr./min przez 3 godziny.
   5. Tymczasem przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami co w kroku 2.3.
   6. Dodaj 5 μl komórek (do sortowania) i komórek kontrolnych do dwóch rurek o okrągłym dnie po 5 ml zawierających odpowiednio 1 ml PBS.
   7. Umieść rurkę z komórkami sterującymi na portie ładowania FACS i kliknij przycisk Load na Pulpitcie Akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj wskaźnik zdarzenia do 1 000 - 3 000 zdarzeń/sek, sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   8. Utwórz skalowany log FSC-A vs. log-scale SSC-A diagram rozrzutowy, klikając przycisk Dot Plot w globalnym arkuszu oprogramowania, a następnie dostosuj scatter gate R1 tak, aby obejmował singlety (populację bakteryjną) za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędzi.
   9. Utwórz wykres rozrzutowy FSC-A w skali logarytmicznej FSC-A vs. FITC-A skalowany logarytmicznie, klikając przycisk Dot Plot na arkuszu, a następnie ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędziowym, tak aby mniej niż 0,1% komórek ujemnych zostało wykrytych w bramce R2.
   10. Zamień probówkę sterującą probówką sortującą i dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń/s, sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   11. Umieść probówkę zbiorczą zawierającą 0,5 ml LB na wylocie instrumentu FACS i posegreguj 10 komórek⁴ spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
       NUTA: Kryterium sortowania może obejmować od górnych 0,1% do 5% FITC-A w bramce R2. W tym protokole górne 1% komórek zostało zebranych jako pozytywne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CopyControl	Epicentrum	CCFOS110	Zestaw produkcyjny biblioteki fosmidów
Rozwiązanie indukcyjne CopyControl	Epicentrum	CCIS125	Roztwór indukcji kopii fosmidowej
EPI300	Epicentrum	EC300110	Ogniwo elektrokompetentne
pCC1FOS	Epicentrum	CCFOS110	Wektor fosmidowy
Gene pulser Mxcell	Bio-Rad		Elektroporacyjne kiwety i układ elektroratanów
FACSAria III	Becton Dickinson		Cytometria przepływowa (maszyna FACS)
AZ100M	Nikon		Mikroskop
Ultraslim	Estrogen		Oświetlenie LED
Rurka stożkowa o pojemności 50 ml	BD Falcon
14 ml rurka z okrągłym dnem	BD Falcon
Rurka z okrągłym dnem 5 ml	BD Falcon
fosforan p-nitrofenylu	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-nitrofenyl β-D-celobiosyd	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-nitrofenylobutyl	Sigma-Aldrich	N9876	Substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, chlorek sodu 10 g/L
Super optymalny bulion (SOB)	BD Difco	244310	Trypton 20 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, chlorek sodu 0,5 g/L, siarczan magnezu 2,4 g/L, chlorek potasu 186 mg/L
Super optymalny bulion z represją katabolitową (SOC)		SOB, 0,4% glukozy
2x ekstrakt drożdżowy trypton (2xYT)	BD Difco	244020	Trawienie kazeiny do trzustki 16 g/L, ekstrakt drożdżowy 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L
Nośniki pamięci komórkowej			2x bulion YT, 15% glicerol, 2% glukozy
pGESS(E135K)			Wektor DNA zawierający dmpR, geny egfp z odpowiednimi promotorami, RBS i terminatorem. Zobacz referencję 5 w rękopisie po więcej szczegółów.
Chloramfenikol	Sigma	C0378
Ampicyliny	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Oprogramowanie do cytometrii przepływowej wersja 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% fosforan dissodu, 0,024% fosforan monopotasowy, pH 7,4