Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Abstract

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Protocol

1. Przygotowanie Biblioteki Metagenomowej z systemem przesiewu enzymów genetycznych do wykrywania p-nitrofenolu (pNP) (pNP-GESS)
   1. Skonstruuj bibliotekę metagenomową w Escherichia coli z wektorem fosmidowym, korzystając z zestawu do produkcji biblioteki fosmidów.
   2. Aliquot 100 μl biblioteki do przechowywania w temperaturze −70 °C, która jest źródłem komórek biblioteki metagenomowej.
      NUTA: Gęstość optyczna próbki mierzonej na długości fali 600 nm (OD₆₀₀) tego zbioru bibliotecznego wynosi około 100.
   3. Rozmroź 100 μl biblioteki metagenomicznej stocku na lodzie i inokuluj w kolbie 500 ml zawierającej 50 ml Luria-Bertani (LB) i 12,5 μg/ml chloramfenikolu, a następnie inkubuj w 37 °C przez 2 godziny.
   4. Komórki pobieraj w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez wirowanie w 1000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Szybko ponownie zawiesz pellet w 50 ml lodowato zimnej wody destylowanej (DW) i ponownie wiruj w 1000 x g przez 20 minut w 4 °C.
   6. Ponownie zawiesić pellet w 50 μl lodowato zimnej masy DW z 10% glicerolem. Do elektroporacji użyj 50 μl tej komórki aliquot.
   7. Umieść mieszaninę elektrokompetentnych ogniw 50 μl i pGESS(E135K) DNA (100ng) w lodowatej elektroporacyjnej cuwette i elektroporacji (1,8 kV/cm, 25 μF) w mieszaninie.
   8. Szybko dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z medium katabolitowym (SOC) i delikatnie zawiesz komórki.
   9. Przełóż komórki do rurki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml za pomocą pipety i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
   10. Rozłóż 500 μl odzyskanych komórek na płytkę LB o wymiarach 20 x 20 cm kwadratowych zawierającą 12,5 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml ampicyliny. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.
   11. Zeskrobaj kolonie za pomocą skrobaka do komórek i zbieraj komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 ml, używając nośnika do przechowywania lodowatych komórek.
   12. Wirować w 1000 x g przez 20 minut w 4 °C. Ponownie zawiesić pellet w 10 ml nośniku chłodzonego na lodowate komórki, aby uzyskać przedawkowanie₆₀₀ na 100.
   13. Zachowaj 20 μl komórek do przechowywania w temperaturze −70 °C.
        
2. Usuwanie fałszywych alarmów z biblioteki metagenomicznej
   1. Rozmrozić komórki biblioteki metagenomowej (od etapu 1.13) zawierające metagenomowe DNA fosmid i pGESS (E135K) na lodzie.
   2. Zainokuluj 10 μl komórek w 2 ml LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w 14-ml probówce z okrągłym dnem. Inkubuj w 37 °C z potrząsaniem przy 200 obr./min przez 4 godziny.
   3. Tymczasem włącz maszynę do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i otwórz domyślne oprogramowanie FACS. Użyj następujących ustawień: średnica końcówki dyszy 70 μm; Czułość na powierzchnię rozpraszania w przód (FSC-A), wzmocnienie 300 V-logarytmicznych; Czułość na obszar rozpraszania bocznego (SSC-A), amplifikacja V-logarytmiczna 350; wrażliwość na obszar izotiocyanianu fluoresceiny (FITC-A), amplifikacja V-logarytmiczna 450; parametr progowy, wartość FSC-A 5.
      NUTA: Typowe ustawienia są podane dla urządzeń FACS wymienionych w Tabeli Materiałów. Dostosuj ustawienia dla innych urządzeń FACS.
   4. Rozcieńcz komórki biblioteki metagenomowej od etapu 2.2, dodając 5 μl próbki do 5-ml probówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
   5. Umieść rozcieńczoną próbkę biblioteki na porcie ładowania instrumentu FACS i kliknij przycisk Load na panelu Acquisition w oprogramowaniu FACS.
   6. Dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 1 500 zdarzeń/sek, klikając i sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   7. Utwórz wykres rozrzutowy FSC-A skalowany według logów w porównaniu do SSC-A skalowanego logarytmem na globalnym arkuszu, klikając przycisk Dot Plot w pasku narzędzi. Dostosuj bramkę rozproszoną R1, aby obejmowała zdarzenia singletów (populację bakterii) za pomocą przycisku Brama Wielokątna na pasku narzędzi.
   8. Narysuj histogram z liczbą komórek w porównaniu do logarytmicznie skalowanego FITC-A na arkuszu, klikając przycisk Histogram. Następnie dostosuj napięcie FITC z zakładki Ustawienia cytometru w oknie Kontroli Inspektora tak, aby szczyt rozkładu w kształcie dzwonu był mniejszy niż 10² FITC-A.
   9. Stwórz skalowanie loga FSC-A vs. wykres log FITC-A poprzez kliknięcie przycisku Dot Plot w globalnym arkuszu. Ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Brama Wielokąta na pasku narzędzi, tak aby bramka znajdowała się pomiędzy +5% a -5% komórek od środka rozkładu (łącznie 10% komórek wokół szczytu krzywej dzwonowej).
   10. Umieść probówkę zawierającą 1,2 ml LB zawierającą 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu na wyjściu z instrumentu FACS i wyodrębnij 10 do⁶ komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
   11. Zdejmij probówkę, korek i delikatnie wyjmij wir.
        
3. Przesiewowe badania enzymów metagenomowych
   1. Inkubuj posortowane komórki (od etapu 2.11) w temperaturze 37 °C, potrząsając z prędkością 200 obr./min, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,5.
   2. Dodaj 1 μl roztworu indukcji kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidów. Inkubuj komórki przez dodatkowe 3 godziny w 37 °C z potrząsania przy 250 obr./min.
   3. Aby przygotować komórki do sortowania, dodaj 0,5 ml hodowanych komórek i odpowiedni substrat (p-nitrofenyloctan, p-nitrofenyl-β-D-celobiosyd lub fenylfosforan) do 14-ml rurki z okrągłym dnem przy końcowym stężeniu 100 μM.
      1. Do próbki kontrolnej dodaj 0,5 ml hodowli komórek z etapu 3.2 do probówki o pojemności 14 ml z okrągłym dnem. Dodaj taką samą objętość PBS jak objętość podłoża w kroku 3.3.
   4. Inkubuj obie próbki w temperaturze 37 °C z potrząsania przy 200 obr./min przez 3 godziny.
   5. Tymczasem przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami co w kroku 2.3.
   6. Dodaj 5 μl komórek (do sortowania) i komórek kontrolnych do dwóch rurek o okrągłym dnie po 5 ml zawierających odpowiednio 1 ml PBS.
   7. Umieść rurkę z komórkami sterującymi na portie ładowania FACS i kliknij przycisk Load na Pulpitcie Akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj wskaźnik zdarzenia do 1 000 - 3 000 zdarzeń/sek, sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   8. Utwórz skalowany log FSC-A vs. log-scale SSC-A diagram rozrzutowy, klikając przycisk Dot Plot w globalnym arkuszu oprogramowania, a następnie dostosuj scatter gate R1 tak, aby obejmował singlety (populację bakteryjną) za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędzi.
   9. Utwórz wykres rozrzutowy FSC-A w skali logarytmicznej FSC-A vs. FITC-A skalowany logarytmicznie, klikając przycisk Dot Plot na arkuszu, a następnie ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędziowym, tak aby mniej niż 0,1% komórek ujemnych zostało wykrytych w bramce R2.
   10. Zamień probówkę sterującą probówką sortującą i dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń/s, sterując przyciskami Flow Rate na pulpicie.
   11. Umieść probówkę zbiorczą zawierającą 0,5 ml LB na wylocie instrumentu FACS i posegreguj 10 komórek⁴ spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.
       NUTA: Kryterium sortowania może obejmować od górnych 0,1% do 5% FITC-A w bramce R2. W tym protokole górne 1% komórek zostało zebranych jako pozytywne.

Materials