Method Article

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

November 28th, 2025

In This Article

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Przygotowanie Biblioteki Metagenomowej z systemem przesiewu enzymów genetycznych do wykrywania p-nitrofenolu (pNP) (pNP-GESS)
    1. Skonstruuj bibliotekę metagenomową w Escherichia coli z wektorem fosmidowym, korzystając z zestawu do produkcji biblioteki fosmidów.
    2. Aliquot 100 μl biblioteki do przechowywania w temperaturze −70 °C, która jest źródłem komórek biblioteki metagenomowej.
      NUTA: Gęstość optyczna próbki mierzonej na długości fali 600 nm (OD600) tego zbioru bibliotecznego wynosi około 100.
    3. Rozmroź 100 μl biblioteki metagenomicznej stocku na lodzie i inokuluj w kolbie 500 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CopyControlEpicentrumCCFOS110Zestaw produkcyjny biblioteki fosmidów
Rozwiązanie indukcyjne CopyControlEpicentrumCCIS125Roztwór indukcji kopii fosmidowej
EPI300EpicentrumEC300110Ogniwo elektrokompetentne
pCC1FOSEpicentrumCCFOS110Wektor fosmidowy
Gene pulser MxcellBio-Rad Elektroporacyjne kiwety i układ elektroratanów
FACSAria IIIBecton Dickinson Cytometria przepływowa (maszyna FACS)
AZ100MNikon Mikroskop
UltraslimEstrogen Oświetlenie LED
Rurka stożkowa o pojemności 50 mlBD Falcon  
14 ml rurka z okrągłym dnemBD Falcon  
Rurka z okrągłym dnem 5 mlBD Falcon  
fosforan p-nitrofenyluSigma-AldrichN7653Substrat
p-nitrofenyl β-D-celobiosydSigma-AldrichN5759Substrat
p-nitrofenylobutylSigma-AldrichN9876Substrat
Luria-Bertani (LB)BD Difco244620Trypton 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, chlorek sodu 10 g/L
Super optymalny bulion (SOB)BD Difco244310Trypton 20 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L, chlorek sodu 0,5 g/L, siarczan magnezu 2,4 g/L, chlorek potasu 186 mg/L
Super optymalny bulion z represją katabolitową (SOC) SOB, 0,4% glukozy 
2x ekstrakt drożdżowy trypton (2xYT)BD Difco244020Trawienie kazeiny do trzustki 16 g/L, ekstrakt drożdżowy 10 g/L, ekstrakt drożdżowy 5 g/L
Nośniki pamięci komórkowej  2x bulion YT, 15% glicerol, 2% glukozy
pGESS(E135K)  Wektor DNA zawierający dmpR, geny egfp z odpowiednimi promotorami, RBS i terminatorem. Zobacz referencję 5 w rękopisie po więcej szczegółów.
ChloramfenikolSigmaC0378 
AmpicylinySigmaA9518 
BD FACSDivaBecton Dickinson Oprogramowanie do cytometrii przepływowej wersja 7.0
PBSGibco70011-0440,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% fosforan dissodu, 0,024% fosforan monopotasowy, pH 7,4

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetically Modified Bacterial CellsEnzyme Expression DetectionFlow Cytometry AnalysisFluorescent Product MeasurementFosmid Library ScreeningChromogenic Substrate IncubationSingle Cell IsolationFACS Machine ParametersForward Scatter GatingFITC area Fluorescence

Related Articles