In vitro Model hodowli partiowej naśladujący fermentację kolonową przez ludzką mikrobiotę jelita

Streszczenie

Źródło: Ahmadi, S. i in. Model hodowli partii in vitro do szacowania efektów reżimów interwencyjnych na ludzką mikrobiotę kałową. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje metodę modelowania fermentacji mikroorganizmów jelitowych poprzez inkubację próbek kału z fermentowalnym błonnikiem w warunkach beztlenowych w celu badania produkcji metabolitów przez mikrobiotę jelitową.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

OSTROŻNOŚĆ: Zapoznaj się z odpowiednimi kartami danych charakterystyki materiałów oraz postępuj zgodnie z instrukcjami i wytycznymi dotyczącymi odpowiedniego szkolenia z zakresu bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 (BSL-2). Przestrzegaj wszystkich kroków hodowli zgodnie ze standardowymi zasadami bezpieczeństwa biologicznego i używaj szafki BSL-2 w warunkach aseptycznych. Ponadto próbki kału z różnych modeli i z różnych osób mogą wiązać się z potencjalnym ryzykiem rozprzestrzeniania chorób przenoszonych przez mikroorganizmy. W razie urazu lub infekcji natychmiast zgłoś się po pomoc medyczną. Ponadto stosowanie próbek kału ludzkiego i zwierzęcego powinno być zatwierdzone przez instytucjonalne komisje etyczne oraz musi być zgodne z protokołami dotyczącymi wykorzystania próbek i informacji o badanych organizmach.

1. Przygotowanie mediów kulturowych

1. Przygotowanie mediów kulturowych, przygotowanie dziewięciu typów roztworów stockowych:
   1. Roztwór A (1 000 mL): Rozpuszcz 5,4 g chlorku sodu (NaCl), 2,7 g diwodoru potasu (KH₂PO₄), 0,16 g chlorku wapnia (CaCl_{2,2H 2}O), 0,12 g heksahydratu chlorku magnezu (MgCl_{2,6H 2}O), 0,06 g chlorku manganu (MnCl_{2,4H 2}O), 0,06 g heksahydratu chlorku kobaltu (CoCl_{2,6H 2}O) oraz 5,4 g siarczanu amonu (NH₄)2SO₄ w wodzie dejonizowanej, aby całkowita objętość wzrosła do 1 000 mL.
   2. Roztwór B (1 000 mL): Rozpuszcz 2,7 g fosforanu potasu (K₂HPO₄) w wodzie dejonizowanej, aby całkowita objętość wyniosła 1000 mL.
   3. Roztwór mineralny śladowy (1 000 mL): Rozpuścić 500 mg dihydratu disody etylendyaminy-tetraacetana (Na₂EDTA), 200 mg heptahydratu siarczanu żelaza (FeSO_{4,7H 2}O), 10 mg heptahydratu siarczanu (ZnSO 4,7H₂O), 3 mg chlorku manganu(II) (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg kwasu fosforowego (H₃PO₄), 20 mg CoCl_{2,6H 2}O, 1 mg chlorku miedzi (CuCl 2,2H₂O), 2 mg heksahydratu chlorku niklu(II) (NiCl_{2,6H 2}O) oraz 3 mg dwuwęglanu sodu (Na₂MoO_{4,2H 2}O) w wodzie dejonizowanej, aby całkowita objętość wyniosła 1 000 mL.
      NUTA: Roztwór ten jest światłoczuły, dlatego należy przechowywać go w tubkach/butelkach owiniętych ciemno/czarnym lub aluminiowym.
   4. Roztwór witaminowy rozpuszczalny w wodzie (1 000 mL): Rozpuścić 100 mg chlorku tiaminy (Thiamin-HCl), 100 mg kwasu D-pantotenowego, 100 mg niacyny, 100 mg pirydoksyny, 5 mg kwasu P-aminobenzoowego oraz 0,25 mg witaminy B12 w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość do 1 000 mL.
   5. Folian: roztwór biotyny (1 000 mL): rozpuszcz 10 mg kwasu foliowego, 2 mg D-biotyny i 100 mg wodorowęglanu amonu (NH₄HCO₃) w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość do 1 000 mL.
   6. Roztwór ryboflawiny (1 000 mL): Rozpuszcz 10 mg ryboflawiny w roztworze HEPES 5 mM (4-(2-hydroksyetylo)piperazyna-1-kwas etansulfonowy) (1,19 g/L), aby uzyskać całkowitą objętość do 1000 mL.
   7. Roztwór Heminu (10 mL): Rozpuszcz 5 000 mg Heminu w roztworze 10 mM wodorotlenku sodu (NaOH) (0,4 g/L), aby uzyskać całkowitą objętość do 10 mL.
   8. Mieszanka kwasów tłuszczowych o krótkich łańcuchach (10 mL): Połącz 2,5 mL N-walerynianu, 2,5 mL izowalanianu, 2,5 mL izobutyranu oraz 2,5 mL: DL-α-metylombutyran.
      NUTA: Zaleca się stosowanie tego rozwiązania w okapie oparowym, aby uniknąć zapachu i oparów.
   9. Rezazuryna (1 000 mL): Rozpuszcz 1 g resazuryny w wodzie dejonizowanej i zwiększ całkowitą objętość do 1 000 mL.
2. Podłoże stosowane do fermentacji beztlenowej in vitro
   1. Aby przygotować ten materiał, wymieszaj 330 mL roztworu A, 330 mL Roztworu B, 10 mL roztworu mineralnego śladowego, 20 mL roztworu witaminowego rozpuszczalnego w wodzie, 5 mL kwasu foliowego: roztwór biotyny, 5 mL roztworu ryboflawiny; 2,5 mL roztworu Hemin, 0,4 mL mieszanki krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, 1 mL Resazuriny, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 4 g węglanu sodu (Na₂CO₃), 0,5 g cysteiny HCl-H₂O oraz 0,5 g tryptykazy oraz dodaj 296,1 mL wody destylowanej.
   2. Sprawdź pH i upewnij się, że jest około 7,0; jeśli nie, dostosuj pH o 1 N HCl lub 1 N NaOH. Sterylizuj przez filtrowanie próżniowe medium za pomocą filtra butelkowego pod stanowiskiem aseptycznym.
   3. Alternatywnie, wymieszaj wszystkie składniki (oprócz witamin i roztworów heminowych) i autoklaw w 121 °C przez 20 minut, pozwól ostygnąć do temperatury pokojowej. Jednocześnie filtruj i sterylizuj roztwory witaminowe i hemin za pomocą filtrów membranowych o pojemności 0,22 μm i dodaj je do autoklawowanego i schłodzonego medium przed podawaniem.

2. Przygotowanie komory beztlenowej i potrzebnych materiałów

1. Wszystkie materiały, roztwory i narzędzia potrzebne do eksperymentu fermentacyjnego przechowywać w komorze beztlenowej co najmniej 48 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić usunięcie resztkowego tlenu związanego z narzędziami oraz rozpuszczalnego tlenu w/roztworach oraz aklimatyzację wszystkich materiałów do ustalonych warunków beztlenowych.
   NUTA: Materiały potrzebne wewnątrz komory beztlenowej (48 godzin wcześniej od rozpoczęcia eksperymentu): (i) medium fermentacyjne; (ii) roztwór beztlenowy (przygotowany zgodnie z sekcją 4.1), (iii) vortexer, (iv) waga wagowa, (v) muślinowe serówki, (vi) nożyczki, (vii) lejek, (viii) probówki 1,5, 2,0, 15, 50 mL, (ix) pipetor (2, 20, 200 i 1 000 μL) oraz kompatybilne końcówki do pipetów, (x) pipety i pipety pistoletowe (5 i 10 mL), (xi) chusteczki papierowe, (xii) markery, (xiii) rurki oznaczające różne rurki, (xiv) pojemnik na odpady, (xv) wskaźnik O2 oraz (xvi) butelka z rozpylaczem etanolu 70% (środek dezynfekujący).

3. Przygotowanie rurek i włókien

1. Waż 300 mg inuliny i przelej do probówki 50 mL, a następnie dodaj aseptycznie 26 ml już przygotowanego i przechowywanego w komórze beztlenowej 26 mL podłoża fermentacyjnego. Przygotuj jedną pustą probówkę dla każdego typu próbki kału oraz probówki eksperymentalnej (w zależności od liczby testowanych związków), w trzech egzemplarzach.
2. Zostaw te probówki w komorze beztlenowej na około 24 godziny, aby umożliwić nawodnienie próbek przed rozpoczęciem eksperymentu fermentacyjnego. Upewnij się, że temperatura w rurce wynosi 37 °C w momencie szczepienia, dlatego przenieś rurki do inkubatora zamknięte w komorze beztlenowej.

4. Przygotowanie inokulum

1. Roztwór beztlenowy rozcieńczający (co najmniej 48 godzin przed eksperymentem fermentacyjnym): Rozpuścić 5 g NaCl, 2 g glukozy i 0,3 g cysteiny-HCl w wodzie dejonizowanej, aby całkowita objętość wynieść 1 000 mL. Autoklawuj i przechowuj go w komorze beztlenowej co najmniej 48 godzin przed użyciem.
2. Przygotowanie inokulum kału (w dniu eksperymentu fermentacyjnego): Waż 5 g świeżej próbki kału w stożkowej probówce o pojemności 50 mL, dodaj beztlenowy roztwór rozcieńczający do końcowej objętości 50 mL (1:10 w/v) i wiruj przez 15 minut lub do całkowitej homogenizacji. Przefiltruj zhomogenizowaną mieszankę przez 4 warstwy sterylnej gazy (autoklawowej) i natychmiast użyj jej do inokulacji w probówkach zawierających media.
   NUTA: Próbki kału z grupy osób można połączyć, jeśli celem eksperymentu jest porównanie wpływu danego związku/składnika na ogólnie zdrową i chorą mikrobiotę kałową.

5. Fermentacja i próbkowanie

1. Przygotuj probówki zgodnie z sekcją 4.2 oraz inokuluj białe i kontrolne oraz eksperymentalne z 4 mL rozcieńczonego i przefiltrowanego inokulum kałowego. Inkubuj zaszczepione rurki w temperaturze 37 °C wewnątrz komory beztlenowej. Potrząśnij rurkami raz na godzinę, delikatnie odwracając je do tyłu, aby ponownie zawiesić włókna i inokulum.
2. Pobieraj próbki tak często, jak to konieczne, na przykład co godzinę do 0, 3, 6, 9 i 24 godzin podczas fermentacji, pobierając próbkę aliquotu 2 mL do probówki 2 mL z odpowiednich probówek fermentującej.
3. Zmierz pH aliquotów za pomocą laboratoryjnego miernika pH (poprzez bezpośrednie włożenie elektrody pH do próbki); wiruj pozostałą próbkę w stężeniu 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Natychmiast zamrażaj supernatant i granulat w ciekłym azocie, a po zamrożeniu przechowuj supernatant do analizy SCFA (krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych) oraz granulat do analizy mikrobiomu w -80 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	217255
Siarczan amonu	TGI	C2388	Toksyczny
Chlorek wapnia dwuwęglan	Sigma-Aldrich	C3306	Irytujące
Heksahydrat chlorku kobaltu	Sigma-Aldrich	255599
Dihydrat chlorku miedzi	Organiki akros	2063450000	Toksyczne, irytujące
Cysteina-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotyna	Sigma-Aldrich	B4501
Kwas D-pantotenowy	Alfa Aesar	A16609
Disodowy dihydrat etylendiaminetetraacetatu	Biorad	1610729
DL-α-metylobutylan	Sigma-Aldrich	W271918
Heptahydrat siarczanu żelaza	Sigma-Aldrich	F8263	Toksyczny
Kwas foliowy	Alfa Aesar	J62937
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Izobutyrat	Alfa Aesar	L04038
Izovalerat	Alfa Aesar	A18642
Heksahydrat chlorku magnezu	Sigma-Aldrich	M8266
Chlorek manganu	Sigma-Aldrich	221279
Niacyna (kwas nikotynowy)	Sigma-Aldrich	N4126
Chlorek niklu(ii) heksahydrat	Alfa Aesar	A14366	Toksyczny
N-walerat	Sigma-Aldrich	240370
Kwas P-aminobenzoowy	MP Chiny	102569	Toksyczne, irytujące
Kwas fosforowy	Sigma-Aldrich	P5811
Fosforan diwodoru potasu	Sigma-Aldrich	P5504
Fosforan potasu	Sigma-Aldrich	1551128
Pirydoksyna	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Ryboflawina	Alfa Aesar	A11764
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	1613757
Chlorek sodu	BioReagenty Fishera	7647-14-5
Wodorotlenek sodu	Fisher Chemicals	S320
Dihydrat sodu	Organiki akros	206375000
Chlorek tiaminy	Organiki akros	148991000
Tryptykaza	BD Biosciences	211921
Witamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	70161
Heptahydrat siarczanu	Sigma-Aldrich	Z0251
Filtr membranowy 0,22 μm
Kulki do oczyszczania magnetycznego AMPure	Agencourt
Komora beztlenowa z inkubatorem	Forma beztlenowy układ, Thermo Scientific, USA
Filtr butelkowy	Corning
Etamina
pH miernik
Wir	Termonaukowe