Mikrotlenowa fermentacja hydrolizatu bambusowego przez Klebsiella pneumoniae

Streszczenie

Źródło: Wei, D. i in., Produkcja chemikaliów przez Klebsiella pneumoniae z użyciem hydrolizatu bambusowego jako surowca. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje mikrobiologiczną przemianę cukrów pochodzących z bambusa w 2,3-butanediol poprzez hodowanie Klebsiella pneumoniae w ośrodku opartym na hydrolizacie w warunkach mikroaerobowych i lekko kwaśnych.

Protokół

1. Produkcja 2,3-butanediolu przez dziki typ K. pneumoniae

1. Do przygotowania medium używaj 3 litrów hydrolizatu bambusowego jako rozpuszczalnika.
2. Przygotuj medium fermentacyjne zawierające 4 g/L kukurydzianego napoju do zaparzania, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄ oraz 0,2 g/L MgSO₄. Reguluj pH medium na neutralne za pomocą 2,5 M NaOH. Do fermentacji użyj bioreaktora 5-litrowego zawierającego 3 litry podłoża fermentacyjnego z autoklawą.
3. Używaj komórek K. pneumoniae przechowywanych w lodówce o niskiej temperaturze -80°C.
4. Do hodowli nasion inkubuj kolbę 250 mL zawierającą 50 ml medium Luria-Bertani (LB) przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając przy 200 obr./min. Użyj medium LB zawierającego 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego oraz 10 g/L NaCl. NUTA: Gęstość komórek kultury nasion powinna osiągnąć OD 2 (gęstość optyczna 600 nm).
5. Zaszczep jedną kolbę o pojemności 50 mL kultury nasion w bioreaktorze. Utrzymuj hodowlę przy pH 6,0 i 37 °C. Stosuj tempo suplementacji powietrzem 2 L/min oraz tempo mieszania 250 obr./min, tworząc warunki mikrotlenowe.
6. Pobieraj 5 ml próbek co 2 godziny podczas fermentacji i analizuj je za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, aby określić stężenia chemiczne w bulionie.
7. Monitoruj zasady dodawane do bioreaktora online, korzystając z systemu mikrobiologicznych ogniw paliwowych/akwizycji danych lub MFCS/DA.
   NUTA: W procesie fermentacji powstają kwasy organiczne, a NaOH jest dodawany, aby utrzymać stabilne pH hodowli. Objętość dodanego zasadu odzwierciedla ilość wytworzonego kwasu. Gdy linia z dodatkiem alkalicznym osiąga plateau, proces kończy się, czy to z powodu wyczerpania się źródeł węgla, czy śmierci komórki.

2. Produkcja R-acetoiny przez mutanta budC K. pneumoniae

1. Przygotuj podłoże do produkcji acetoiny zawierające 4 g/L parzenia kukurydzianego, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L octana sodu, 0,4 g/L KCl oraz 0,1 g/L MgSO₄.
2. Do produkcji R-acetoiny używaj K. pneumoniae-ΔbudC. Powtórz kroki 1.4-1.5.
   UWAGA: budC koduje dehydrogenazę 2,3-butanediol. K. pneumoniae-ΔbudC traci aktywność dehydrogenazy 2,3-butanediol i produkuje R-acetoinę zamiast 2,3-butanediolu.
3. Utrzymuj hodowlę przy pH 6,0 i 37 °C. Stosuj tempo suplementacji powietrzem 4 L/min oraz tempo mieszania 450 obr./min, co jest warunkiem tlenowym.
   NUTA: Suplementacja tlenu jest wyższa niż produkcja 2,3-butanediolu.
4. Przeanalizuj próbki zgodnie z krokiem 1.6.

3. Produkcja kwasu 2-ketoglukonowego przez mutanta budA K. pneumoniae

1. Do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego używaj tego samego medium co do produkcji R-acetoiny.
2. Do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego stosuj K. pneumoniae-ΔbudA . Powtórz kroki 1.4-1.5.
   UWAGA: budA koduje dekarboksylazę α-acetolaktianu. K. pneumoniae-ΔbudA traci aktywność dekarboksylazy α-acetolaktianu i produkuje kwas 2-ketoglukonowy, wykorzystując glukozę jako podłoże.
   UWAGA: Synteza kwasu 2-ketoglukonowego jest procesem zależnym od warunków kwasowych. Opracowano fermentację dwustopniową do produkcji kwasu 2-ketoglukonowego; W pierwszym etapie kultura nasion jest zaszczepiana do bioreaktora.
3. Utrzymuj hodowlę przy pH 7,0 i 37 °C. Stosuj częstotliwość uzupełniania powietrza 4 L/min oraz mieszanie 500 obr./min.
   NUTA: W takich warunkach komórki rosną bardzo szybko (gęstość komórek osiąga OD 7 w około 4 godziny). Następnie fermentacja przechodzi do drugiego etapu, podczas którego pH kultury spada do 5,0. Nie dodaje się kwasu; kwasy organiczne produkowane w hodowli naturalnie prowadzą do obniżenia pH. W tych kwaśnych warunkach wzrost komórek zatrzymuje się, ale w bulionie powstaje kwas 2-ketoglukonowy, który gromadzi się w bulionie.
4. Przeanalizuj próbki zgodnie z krokiem 1.6. Wykorzystanie hydrolizatu bambusa jako źródła węgla.
   NUTA: Glukoza w podłożu przekształca się w kwas 2-ketoglukonowy, a ksyloza w kwas ksylonowy. W ten sposób otrzymuje się mieszaninę kwasu 2-ketoglukonowego i ksylonowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Autoklaw	SANYO	3780
Bioreaktor	Sartorius stedim biotech	Bostat Aplus
Agitator	IKA	RW 20
System wysokowydajnego chromatografu ciekłego	Shimadzu Corp	20AVP
Proszek bambusowy	Zakupiony od prowincji Zhejiang, Chiny		Numer siatki, 50
Celulaza	Powiedz Biochemical, Shandong, Chiny		200 PFU/mL