$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ekstrakcja metabolitów
- Rozmrażaj próbki na mokrym lodzie i rozbijaj komórki w homogenizatorze z czterema wybuchami po 30 sekund przy 6 000 obr./min, z 2-minutowymi okresami chłodzenia na suchym lodzie między cyklami.
- Lizaty klarować przez 15 minut w schłodzonej, schłodzonej mikrowirówce z maksymalną prędkością (czyli 18 213 x g w ≤4 °C).
- Przelej supernatant do czystej rurki mikrowirówki.
- Za pomocą mikropipety przenieś niewielką część próbki do probówki mikrowirówki w celu ilościowego określenia zawartości peptydów resztkowych w kroku 2; resztę przechowywać w temperaturze -80 °C.
NUTA: Objętość zarezerwowanej próbki różni się w zależności od testu kwasu bicynchoninowego (BCA) zastosowanego w kroku 2.1. Próbkę tę należy przechowywać na mokrym lodzie do natychmiastowej analizy lub zamrażać w temperaturze -80 °C.
2. Test kwasu bicinchoninowego (BCA)
- Wykonaj test BCA zgodnie z zaleceniami producenta zestawu, używając próbek z etapu 1.4 do określenia stężenia peptydu dla każdej próbki.
3. Chromatografia cieczowa – spektrometria mas (LC-MS)
- Wymieszaj 75 μL ekstraktu Staphylococcus aureus (S. aureus) z 75 μL rozpuszczalnika LC-MS B, przygotowanego w kroku 1.4.
- Wiruj i zakręcam w 13 000 x g przez 5 minut.
- Włóż 100 μL supernatantu do fiolki do chromatografii cieczowej (LC) i zakap ją. Upewnij się, że w próbce nie zostaną uwięzione pęcherzyki powietrza.
- Załaduj fiolki LC do autosamplera LC-MS i edytuj listę bieżącą w oprogramowaniu "Offline Worklist Editor".
- Wypełnij kolumny "Sample Name" (np. wild-type-1), "Sample Position" (np. P1-A1), "Method" (np. Metoda kwasu mrówkowego-ujemna) oraz "Data File" (np. wild-type-1). Kliknij przycisk "Zapisz listę zadań". Otwórz oprogramowanie "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" i wprowadź wcześniej zapisaną listę zadań. Kliknij przycisk "Start Worklist Run", aby rozpocząć ciągły pomiar LC-MS.
- Oddziel próbki na kolumnie, połącz kolumnę ze spektrometrem czasu lotu (TOF) i połącz spektrometr TOF z systemem LC. Stosuj gradient fazy ruchomej w następujący sposób: 0-2 min, 85% rozpuszczalnika B; 3-5 min, 80% rozpuszczalnik B; 6-7 min, 75% rozpuszczalnika B; 8-9 min, 70% rozpuszczalnik B; 10-11,1 min, 50% rozpuszczalnik B; 11,1-14 min, 20% rozpuszczalnik B; oraz 14,1-24 min, 5% rozpuszczalnika B; zakończ się 10-minutowym okresem równowagi przy 85% rozpuszczalniku B i przepływie 0,4 mL min-1.
- Za pomocą pompy izokratycznej wprowadzić do przebiegu roztwór masy odniesienia, aby umożliwić jednoczesną kalibrację osi masy.
NUTA: Ten krok opiera się na standardowej instrukcji spektrometru TOF.- Do kalibracji w czasie rzeczywistym użyj mieszaniny kwasu octowego D4 i heksakis (1H,1H,3H-tetrafluoropropoksi) fosfazyny jako roztworu masowego referencyjnego. Użyj pompy izokratycznej o przepływie 2,5 mL min-1 do infuzji.
4. Korekcja partii liczebności jonów
- Wyznacz dowolną próbkę jako próbkę referencyjną do korekty wsadowej (np. typ dziki, replikuj 1).
- Oblicz sumę liczebności jonów dla wszystkich metabolitów w próbce referencyjnej. Powtórz to obliczenie dla wszystkich próbek.
- Podziel całkowitą liczbę jonów każdej próbki przez całkowitą liczbę jonów próbki referencyjnej, aby uzyskać stosunek.
- Podziel liczbę jonów dla każdego metabolitu w próbce przez stosunek próbki do odniesienia, aby uzyskać skorygowaną liczbę jonów partii dla każdego metabolitu.
5. Normalizacja peptydów
- Podziel wartości jonowe skorygowane partią dla każdej próbki uzyskanej w kroku 4 przez stężenie peptydu określone za pomocą testu BCA w kroku 2, aby uzyskać znormalizowaną wartość dla każdego metabolitu.
NUTA: Znormalizowane, partiowo skorygowane liczby jonów dla każdego metabolitu uzyskane w kroku 5.1 można bezpośrednio porównać między szczepami i poddać analizie statystycznej (np. testowi Mann-Whitney U). Alternatywnie, metabolit znany jako niezmieniony przez leczenie lub tło genetyczne może być używany jako normalizator do wykrywania zmian spowodowanych rozkładem metabolitów. Wprowadzenie znanej ilości L-norwaliny lub kwasu glutarynowego do buforu ekstrakcyjnego może być użyte do korekty strat podczas przetwarzania próbki.