Monitorowanie wzrostu bakterii w różnych formułach ośrodka za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora

Streszczenie

Źródło: Hemmerich, J. i in. Protokół optymalizacji heterologicznego wytwarzania białek z wykorzystaniem zautomatyzowanej technologii mikrobioreaktorów. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje użycie zautomatyzowanego mikrobioreaktora do monitorowania wzrostu bakterii i wydzielania białek fluorescencyjnej w odpowiedzi na różne formuły mediów. Genetycznie zmodyfikowana bakteria ekspresyjna wydzielniowa fluorescencja jest hodowana pod antybiotykowym selekcją i zaszczepiana w dołkach o zróżnicowanych składnikach odżywczych. Optyczne pomiary gęstości komórek i fluorescencji w czasie rzeczywistym umożliwiają porównawczą analizę produkcji białek w różnych warunkach wzrostu.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów i procedury definiowania
NUTA: Zaleca się szczegółowe określenie i ustalenie metod eksperymentalnych. Ta standaryzacja zapewnia, że różne wyniki można przewidzieć z wewnętrzną zmiennością biologiczną lub różnym składem ośrodków. ​
NUTA: Usługi dotyczące zasobów medialnych: Przygotuj indywidualne rozwiązania dla wszystkich badanych komponentów mediów. Przygotuj silnie skoncentrowane zapasy, aby umożliwić rozcieńczenie różnych objętości dla wszystkich składników. Oznacza to, że po połączeniu wszystkich roztworów bulwarowych w ich największej objętości zgodnie z planem projektowym, nie może to przekroczyć końcowej objętości uprawy, por. akapit: "Generowanie listy pipetowania roztworów średnich materiałów materiałowych" krok 1.3.3. Jeśli dodanie roztworu o wysokim stężeniu skutkuje bardzo niską objętością dodatku, np. < 1/100 końcowej objętości uprawy, odpowiednio rozcieńcz roztwór bulwy. Na przykład w tym badaniu objętość pipetowania mniejsza niż 10 μL została zdefiniowana jako niewykonalna. Zazwyczaj roztwory pierwiastków śladowych koncentruje się nawet do 1000-krotnie względem końcowego stężenia standardowego w ośrodku. Korzystne jest koncentrowanie składników nośnika jako wielokrotności (X-krotnie) względem stężenia w przepisie referencyjnym. Dzięki temu unika się niewykonalnych ilości pipetowania ułamkowych dziesiętnych. Szczegółowe przepisy dla wszystkich roztworów wywaru medium CgXII znajdują się w dokumencie uzupełniającym.

1. Działający bank komórkowy (WCB)
Uwaga: Dla każdego eksperymentu wzrostu używa się jednego aliquotu WCB. Jeśli potrzebne są dodatkowe kolbyki, użyj 100 mL infuzji mózgu sercowej (BHI) w 1000 mL flafowanych kolbiczek lub zaszczep kilka kolbic, które gromadzą przed dodaniem roztworu glicerolu.

1. Przygotuj pojedyncze kolonie rekombinowanego szczepu ekspresyjnego C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 na płytkach agarowych (37 g/L BHI w proszku, 20 g/L agar, 25 mg/L kanamycyny). Materiał powłokowy może pochodzić z nowej transformacji lub z krioprezerwacji aliquot. Inkubować w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się pojedynczych kolonii; Zazwyczaj zajmuje to od jednego do dwóch dni.
2. Zaszczepić hodowlę w kolbie shaker (50 mL BHI z 25 mg/l kanamycyny, 500 mL kolbę z przegrodą, 250 obr./min, średnica wstrząsania 25 mm, 30 °C) materiałem z kolonii i inkubować przez noc (około 16 godzin).
3. Połącz jedną objętość powstałej zawiesiny komórkowej z jedną objętością 500 g/l sterylnego roztworu glicerolu i rozprowadz ją w 2 mL aliquotach w sterylnych fiolkach kriokonserwacji. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Protokół kultywacji MBR
Nuta: W zastosowanym systemie BioLector MBR w tym badaniu pomiary intensywności światła rozproszonego (biomasa) i fluorescencji GFP są pomiarami intensywności, które wymagają przypisania określonej wartości wzmocnienia. Im wyższe wzmocnienie, tym silniej wzmacnia się sygnał optyczny; Dlatego także światło rozproszone i fluorescencja mierzy się w jednostkach dowolnych (A.U.). Określić odpowiednie wartości wzmocnienia do wykrywania biomasy i GFP w eksperymentach wstępnych, a także odpowiednią częstotliwość wstrząsów i objętość wypełnienia, aby uniknąć ograniczenia tlenu przy wyższych stężeniach biomasy w późniejszych etapach procesu. Stosowane warunki uprawy ("Flowerplates", czyli kwiatowe MTP z 48 dołkami, częstotliwość wstrząsania 1 200 obr./min, objętość nadziejna 1 000 μL, 10 g/l glukozy jako główne źródło węgla) zapewniały uprawy bez dostępu do tlenu. Aby uzyskać maksymalne prędkości transferu tlenu wynikające z innych kombinacji objętości napełniania i częstotliwości wstrząsania w kwiatowych MTP z 48 dołkami, dostępne są karty katalogowe od dostawcy. Ponadto mogą wystąpić wady wzrostu pojedynczych hodowli z powodu niskiej ilości wtórnych substratów (np. azotu, pierwiastków śladowych). Dlatego sprawdź stężenia biomasy na koniec uprawy. W tym badaniu nie zaobserwowano takich efektów wzrostu.

1. Zdefiniuj protokół kultywacji dla systemu MBR ("BioLector") następująco:
2. Zestaw filtrów 1: Biomasa, wzmocnienie 14. Zestaw filtrów 2: pH, wzmocnienie jest ustawione na maksa. Zestaw filtrów 3: pO2, wzmocnienie jest ustawione na maksa. 4: GFP, wzrost 80.
3. Częstotliwość drgań: 1200 obr./min.
4. Temperatura: 30 °C.
5. Czas cyklu: 15 min.
6. Czas eksperymentu: ręczny (Uprawa nie zostanie automatycznie zatrzymana).

3. Generowanie listy pipetowania roztworów średnich
Nuta: Prawie każdy robot do obsługi cieczy jest zdolny do odczytywania akcji pipetowania z zewnętrznych plików. Zasadniczo minimalne informacje to objętość transferu i pozycja źródła odczynnika, a także miejsce docelowe każdego z nich, reprezentowane przez pozycję sprzętu laboratoryjnego na pokładzie robota oraz konkretną wnękę w laboratorium. Jednak należy uwzględnić różne składnie dla różnych systemów obsługi cieczy. Rysunek 1 przedstawia przykładową strukturę pliku dla zastosowanego systemu pipetowania w tym badaniu.

1. Do każdej studni uprawnej podłącza się cztery rodzaje roztworów bulwarowych:

1. Rozwiązania stockowe komponentów mediów, które są zróżnicowane ("Variation Stocks").
2. Woda w celu zrekompensowania różnych skumulowanych objętości powyższych zasobów.
3. Roztwór zapasowy ("Rest Stock") zawierający wszystkie komponenty, które są stałe. Roztwór ten może być złożony z zapasów zawierających różne składniki, które są np. przechowywane w różnych temperaturach lub sterylizowane różnymi metodami.
4. Inokulum, które należy dodać jako ostatni składnik i umieścić na stole roboczym przed dodaniem, aby zapobiec osiadaniu komórek.

2. Na studnię uprawną oblicz objętości, które mają być przeniesione dla wszystkich komponentów podłoża zgodnie z:

Wolumen do dodania dla niektórych Variation Stocks może być zerowy, czyli gdy ten konkretny komponent zostanie pominięty.

3. Popraw wszystkie obliczone objętości Vi pod kątem odpowiednich liczb. Przyrosty objętości pipetowania w krokach objętościowych nie powinny być zbyt małe. W razie potrzeby dostosuj stężenia zapasów zmiennych. Na przykład minimalna objętość pipetowania tutaj została zdefiniowana jako 10 μL, a minimalny przyrost jako 5 μL. Ogólnie rzecz biorąc, te objętości powinny być definiowane na podstawie eksperymentalnie ustalonej precyzji i dokładności dla używanej stacji obsługi cieczy.

4. Oblicz objętość zapasów spoczynkowych zawierających stałe składniki dla wszystkich odwiertów w następujący sposób:

gdzie używana jest maksymalna skumulowana objętość zapasów wariacyjnych. W związku z tym oblicz wymagane stężenia stałych składników w zapasach spoczynkowych w następujący sposób:

Przygotuj zapas Reszty odpowiednio.

5. Na studnię uprawną oblicz objętość wody, którą należy dodać w następujący sposób:

6. Na każdą studnię uprawy wypisz wszystkie objętości do dodania w następującej kolejności: V_H2O, V_RestStock, V_i, V_Inok. Sformatuj listę pipetowania zgodnie ze specyfikacją stacji obsługi cieczy, jak pokazano na przykład na Rysunku 1.

2. Hodowla nasion, automatyczne przygotowanie podłoża i rozpoczęcie uprawy głównej

1. Stwórz protokół dla robota do obsługi cieczy. Zobacz Rysunek 2 i Rysunek 3 , aby zobaczyć przykładowy protokół dla systemu "Janus", zaimplementowanego w odpowiednim oprogramowaniu "WinPREP". Protokół powinien uwzględniać następujące aspekty:

1. Uwzględnić odpowiedni czas produkcji sterylnych obudów przed przygotowaniem mediów.

2. Wstępne nadmierne czyszczenie i mycie wszystkich końcówek pipetujących i rurek.

3. Wybieraj odpowiednie pojemniki laboratoryjne na produkty do wywaru. Tutaj płyty głębokie z 12 kolumnami są odpowiednie do przechowywania zapasów Variation, ponieważ wszystkie osiem końcówek pipetujących można zanurzać równolegle w kolumnach odwiertów. To znacznie przyspiesza przygotowania do mediów. Jeśli jako rezerwuary używa się rurek odczynnikowych o pojemności 15 mL lub 50 mL, do nich może jednocześnie wpłynąć tylko jedna końcówka pipetowania. Dla innych zapasów, takich jak woda i zapas spoczynkowy, stosuje się koryta 100 mL, ponieważ te rozwiązania wymagają łącznie większych ilości.

4. Zapewnienie wystarczającej całkowitej objętości dla każdego roztworu zapasowego, aby zrekompensować objętości odpadów, wysokość przesunięcia pipetowania itp.

5. Wstaw komunikat użytkownika przed krokiem szczepienia, aby upewnić się, że ten krok zostanie wykonany bezpośrednio przed procedurą hodowli nasion.

2. Przygotuj wszystkie roztwory w sposób sterylny i przechowuj do czasu użycia, w odpowiednich pojemnikach, np. w jałowych probówkach 15 mL i 50 mL.
3. Sterylizuj płytki głębokie do przechowywania roztworu na stole roboczym, np. przecieraj etanolem 70% i następnie susząc w laminarnym okapie przepływowym.
4. Rozpocznij hodowlę nasion od zaszczepienia 50 mL podłoża BHI zawierającego 25 mg/L kanamycyny z jednym aliquotem z WCB. Przed uprawą MBR przygotuj świeże, niezbędne inokulum z wykładniczo rosnących upraw nasion w odpowiedniej ilości.
5. Umieść wszystkie niezbędne naczynie laboratoryjne na robotycznym stole roboczym i wlej roztwory do odpowiednich założeń laboratoryjnych.
6. Rozpocznij robotyczny proces przygotowania submedia, tak aby ostatni etap (inokulacja) został osiągnięty na czas z rozpoczęciem hodowli nasion. Całkowity czas działania robotycznego przepływu pracy musi być wcześniej oceniony. Tutaj całkowity czas trwania wynosił około 1,5 godziny.
7. Pobieraj próbkę z kultury nasion po około 2 godzinach, a następnie co godzinę, aby monitorować wzrost pod względem gęstości optycznej (OD₆₀₀). Po około 5 godzinach hodowla osiąga 3-4 OD₆₀₀ i jest używana do szczepienia głównych kultur.
8. Umieść hodowlę nasion na stole roboczym do obsługi płynnej i kontynuuj protokół przygotowania media. Uprawa fok MTP po inokulacji.
9. Umieść zamknięty MTP do uprawy w urządzeniu BioLector i rozpocznij zdefiniowany protokół kultywacji.
10. Pozbądź się pozostałych roztworów z materiału, zgodnie z przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego, jeśli to konieczne, i wysiewaj hodowlę z robotycznego stołu roboczego. Wyczyść wielorazowe wyposażenie laboratoryjne i rozpocząć protokół dekontaminacji przez obsługę płynów.

Wyniki

Rysunek 1: Zrzut ekranu z listy pipetowania objętościowego do analizy czułości. Wpisy w pierwszej kolumnie przypisują unikalny identyfikator wszystkim woluminom wiersza; ten identyfikator to numer studni MTP docelowej uprawy MTP na tablicy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BioLector	m2p-labs	G-BL-100
Kwiatowa płyta	m2p-labs	MTP-48-BOH	Do uprawy w urządzeniu BioLector
Folia uszczelniająca	m2p-labs	F-GP-10	Sterylne uszczelnienie dla Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	N/a	Dostępny za darmo, wymagana instalacja MATLAB-a
Robot pipetujący Janus	Perkin Elmer	N/a	Zawiera instalację oprogramowania "WinPrep"
Mikropłytka głęboka z 12-kolumnową głębokością	E&K Scientific	EK-2034	Pojemnik na roztwory średnie
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	N/a	N/a	Zawiera plazmid pEKEx2 z fuzją genu GFP i peptydu sygnałowego PhoD z B. subtilis jako wkład ekspresyjny. Plazmid zapewnia oporność na kanamycynę. Opisane i opublikowane przez Meissner i in. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)