Długoterminowa krioprezerwacja szczepów cyjanobakterii z użyciem glicerolu lub dimetylosulfoksydu

Streszczenie

Źródło: Lea-Smith, D. J., i in. Generowanie mutantów oznaczonych i bezznacznikowych u modelowych gatunków cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje krioprezerwację szczepów cyjanobakterii poprzez łączenie skoncentrowanych zawiesin komórkowych z glicerolem lub DMSO i przechowywanie ich w niskich temperaturach, co umożliwia długoterminowe utrzymanie żywotnych hodowli do fotosyntezy i badań genetycznych.

Protokół

1. Przygotowanie mediów kulturowych

1. Przygotuj BG11 medium
   1. Przygotuj roztwory zapasowe 100x BG11, pierwiastki śladowe i bulion żelazny (Tabela 1).
   2. Przygotuj oddzielne roztwory z bulionu fosforanowego, węglanu sodu (Na₂CO₃), bulwaru N-[Tris(hydroksymetylo)metyl] -2-aminoetanolu sulfonowego (TES) buforu oraz wodorowęglanu sodu (NaHCO₃) (Tabela 1).
   3. Autoklaw fosforanów i Na₂CO₃ . Filtr sterylizuje bufor TES oraz NaHCO₃ filtrami 0,2 μm.
   4. Przygotuj BG11, łącząc 976 ml wody, 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml wywaru żelaza, a następnie podłącz roztwór do autoklawu. Po ostygnięciu tego roztworu do temperatury pokojowej dodaj 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na_{2CO 3} oraz 10 ml NaHCO₃.
   5. Do BG11 jako medium stałego dodaj 15 g agaru i 700 ml wody do jednej kolby. Do drugiej kolby dodaj 3 g tiosiarczanu sodu (Na₂S₂O₃), 226 ml wody, 10 ml 100x BG11, 1 ml pierwiastków śladowych i 1 ml bulionu żelaza. Autoklawuj oba rozwiązania. Po ostygnięciu roztworów do temperatury pokojowej należy je połączyć i dodać 1 ml bulionu fosforanowego, 1 ml bulionu Na₂CO₃ , 10 ml buforu TES oraz 10 ml NaHCO₃.
      NUTA: Roztwory przygotowuje się osobno, aby uniknąć wytrącania niektórych soli.
2. Do wyboru na sacharozie przygotuj 50% (w/v) roztwór sacharozy. Filtr sterylizuje roztwór filtrami 0,2 μm i dodaje do BG11 (100 ml 50% sacharozy do 900 ml BG11), aby uzyskać płytki sacharozy BG11/5%.
   NUTA: Nie dodawaj NaHCO₃ do płytek agarowych BG11/5% sacharozy. Dodaj Na₂CO₃ normalnie.
3. Do hodowli Synechococcus należy dodać 10 ml 1 ml kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyny-1-etynosulfonowego, N-(2-hydroksyetylo)piperazyny-N′-(2-kwasu etansulfonowego) (HEPES) oraz 1 ml witaminy B12 (Tabela 1) do 1 litra podłoża BG11.
   NUTA: Transformacja szczepów hodowanych w komercyjnie dostępnych podłożach BG11 jest znacznie mniej efektywna niż w przepisach opisanych tutaj na BG11, dlatego nie jest zalecana.

2. Długoterminowe przechowywanie odkształcenia

1. Ułóż świeżą hodowlę szczepu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30-50 ml podłoża BG11. Uprawiaj hodowlę przez 3-4 dni do OD_750nm = 0,4 do 0,7.
2. Komórki raz przemyj BG11 i ponownie zawiesij w ~2 ml BG11.
3. Dodaj 0,8 ml skoncentrowanych komórek do jednej probówki. Następnie dodaj 0,2 ml glicerolu sterylizowanego filtrem 80%.
4. Opcjonalnie: Dodaj 0,93 ml skoncentrowanych komórek do innej probówki. Dodaj 0,07 ml DMSO do tej rurki.
   OSTROŻNOŚĆ: DMSO jest toksyczne i należy je traktować z odpowiednią ochroną.
5. Przechowuj obie rurki w temperaturze -80 °C. Aby ożywić szczepy, usuń rurkę i zeskrobaj niektóre komórki wykałaczką na płytkę agarową bez antybiotyków. Rozbiegnij się normalnie, używając sterylnej pętli.

Tabela 1: Rozwiązania użyte w tym badaniu

Przepisy na roztwory bulionowe
Chemiczny	Ilość (g)
100x BG11 (na L)
NaNO3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2,2H 2O	3.6
Kwas cytrynowy	0.6
Dodaj 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0
0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (na 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Pierwiastki śladowe (na 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2,4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4.2H 2O	0.039
CuSO4,5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
Kolba żelazna (na 100 ml)
Cytrynian amonu żelaza	1.11
Zapas fosforanów (na 100 ml)
K2HPO4	3.05
Na2CO3 bulion (na 100 ml)
Na2CO3	2
Bufor TES, pH 8,2 (na 100 ml)
TES	22.9
NaHCO3 (na 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (na 500 ml)
HEPES	119.15
Witamina B12 (na 50 ml)
Cyjanokobalamina	0.02
Luria Bertani media (na 500 ml)
Bulion Luria Bertani	12.5
1 M MgCl2 (na 100 ml)
MgCl 2,6H 2O	20.33
Roztwór A (na 200 ml)
MnCl2,4H 2O	0.395
CaCl2,2H 2O	1.47
2-(N-Morfolino)etanolowy hydrat kwasu etansulfonowego, 4-kwas morfolienosulfonowy (MES)	0.4265
Roztwór A + glicerol
10 ml roztworu A
1,5 ml glicerolu

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Kwas cytrynowy	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Rybak	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Cytrynian amonu żelaza	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Rybak	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Rybak	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cyjanokobalamina	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sacharoza	Rybak	SUC001
Miska Petriego 90 mm z potrójnym wywiechem	Greiner	633185
Filtry 0,2 μm	Sartorius	16534
100 ml stożkowe kolby	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion polimeraza DNA o wysokiej wierności	Phusion	F-530
Agarozy	Melford	MB1200
Zestaw do oczyszczania DNA	MoBio	12100-300
Endonukleazy restrykcyjne	NEB
Ligaza T4	Thermo Scientific	EL0011
Bulion Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Siarczan kanamicyny	Sigma	60615
Ampicyliny	Sigma	A9518
Miniprep GeneJET do miniprepów plazmidów	Thermo Scientific	K0503
14 ml rurka z okrągłym dnem	BD Falcon	352059
Polimeraza DNA GoTaq G2 Flexi	Promega	M7805
Koraliki szklane o średnicy 425-600 μm	Sigma	G8772
Glicerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Żarówki świetlówkowe	Gro-Lux	69
Fotobioreaktor HT multitron	Infors