Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, stresie oksydacyjnym, apoptozie, starzeniu się organizmu, encefalomiopatiach mitochondrialnych oraz toksyczności leków. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na technologie pozwalające mierzyć funkcje mitochondriów w sercu. Jedną z technik wykorzystujących podejście integracyjne do pomiaru funkcji mitochondrialnych jest respirometryczna analiza fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS).
Zasada oceny OXPHOS metodą respirometryczną opiera się na pomiarze stężenia tlenu przy użyciu elektrody Clarka. W miarę jak permeabilizowany pęczek włókien zużywa tlen, jego stężenie w zamkniętej komorze spada. Dzięki zastosowaniu wybranych protokołów miareczkowania substratami, inhibitorami i odsprzęgaczami, elektrony są dostarczane do konkretnych miejsc łańcucha transportu elektronów, co umożliwia ocenę funkcji mitochondriów. Przed analizą respirometryczną funkcji mitochondrialnych stosuje się mechaniczne i chemiczne techniki przygotowawcze w celu permeabilizacji sarkolemmy włókien mięśniowych. Permeabilizacja chemiczna wykorzystuje saponinę do selektywnego perforowania błony komórkowej przy zachowaniu architektury komórkowej.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje etapy przygotowania włókien sercowych pozbawionych błon komórkowych za pomocą saponiny do pomiarów zużycia tlenu w celu oceny mitochondrialnego OXPHOS. Ponadto przedstawiono wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, a także określone substraty, inhibitory i odsprzęgacze, które mogą być wykorzystane do określenia funkcji mitochondriów w konkretnych miejscach łańcucha transportu elektronów. Co istotne, opisany protokół można łatwo zastosować do tkanek serca i mięśni szkieletowych różnych modeli zwierzęcych oraz próbek ludzkich.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Roztwór do relaksacji i konserwacji (roztwór RP) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami1. W skrócie, roztwór RP składa się z 2.77mM CaK2EGTA, 7.23mM K2EGTA, 20mM imidazolu, 0.5mM ditiotreitolu, 20mM tauryny, 50mM K-MES, 6.56 MgCl2, 5.7mM ATP, 14.3mM fosfokreatyny, pH 7.1, dostosowane w temperaturze pokojowej (RT). Przefiltrować roztwór przez filtr 0.45-μm w celu sterylizacji. Rozdzielić na porcje po 15 mL (polipropylenowe probówki Falcon) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przepisy znajdują się w części dyskusyjnej.
- Roztwór do respirometrii mitochondrialnej (MiR05) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem2; zawiera on 0.5mM EGTA, 3mM MgCl2.6H2O, 20mM tauryny, 10mM KH2PO4, 20mM HEPES, 1g/L BSA, 60mM laktobionianu potasu, 10mM sacharozy, pH 7.1, dostosowane w temperaturze 30°C. Przefiltrować roztwór przez filtr 0.45-μm w celu sterylizacji. Rozdzielić na porcje po 50 mL (polipropylenowe probówki Falcon) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przepisy znajdują się w części dyskusyjnej. Współczynnik rozpuszczalności tlenu dla MiR05 w temperaturze 30°C i 37°C wynosi 0.923.
2. Przygotowanie tkanek
A. Mechaniczne przygotowanie włókien serca
- Procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych dotyczącymi eksperymentów.
- Preferowaną metodą unieruchomienia myszy jest zwichnięcie stawów szyjnych. Alternatywnie można podać dojamistrznie (IP) ketaminę i ksylazynę (odpowiednio 80 i 10mg/kg) lub 0,5mg/kg pentobarbitalu sodowego. Uwaga: Pentobarbital sodowy jest odwracalnym inhibitorem dehydrogenazy NADH (kompleks I)4.
- Wyjąć serce i umieścić je w szalce Petriego zawierającej roztwór RP na lodzie (Rysunek 1A). Ostrożnie usunąć wszelką tkankę łączną i/lub tłuszcz, korzystając z mikroskopu sekcyjnego.
- Przeciąć serce na pół wzdłuż przegrody. Wyciąć 10-25mg masy mokrej (ww) tkanki, tnąc od strony wsierdzia lewej komory (Rysunek 1B). Należy upewnić się, że nacięcie przebiega wzdłuż orientacji włókien, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne mięśnia sercowego.
- Umieścić wyciętą próbkę tkanki w oddzielnej szalce Petriego zawierającej roztwór RP na lodzie. Za pomocą mikroskopu sekcyjnego pociąć serce na paski podłużne wzdłuż orientacji włókien o średnicy 1-1,5mm.
- Skrócić paski za pomocą skalpela do długości 2-4mm (Rysunek 1C).
- Zachowując szczególną ostrożność i używając ostrych pęset, mechanicznie rozdzielić pęczki włókien. Końcowe pęczki włókien powinny zawierać maksymalnie 6-8 włókien, połączonych małymi obszarami styku, i ważyć nie więcej niż 5mg ww. Zaleca się stosowanie włókien sercowych o masie 1-3mg ww. Wizualnie tkanka serca powinna zmienić kolor z oryginalnego czerwonego na bladoróżowy (Rysunek 1D).
B. Przygotowanie chemiczne pęczków włókien serca
- Umieścić płytkę 12-dołkową na lodzie.
- Przepłukać dołek(i) roztworem RP, aby zminimalizować zanieczyszczenie wapniem5.
- Przenieść mechanicznie przygotowane pęczki włókien dołka zawierającego 3mL lodowatego roztworu RP z 50ug/mL saponiny. Uwaga: Stężenie saponiny nie zależy od ilości mięśnia sercowego obecnego w roztworze.
- Inkubować przez 20min na lodzie przy łagodnym mieszaniu.
C. Płukanie wiązek włókien sercowych
- Przepłucz nową studzienkę roztworem MiR05, aby zminimalizować zanieczyszczenie wapniem5.
- Przenieś pęczki włókien sercowych do nowej studzienki zawierającej 10mL schłodzonego do temperatury lodu roztworu MiR05. Inkubuj przez 10min na lodzie przy delikatnym mieszaniu.
- Powtórz czynności (1-2) 2-3 razy, używając świeżego roztworu MiR05. Powtarzane etapy płukania mają na celu zapewnienie usunięcia saponiny, ATP, ADP oraz wszelkich pozostałych substratów z pęczków włókien.
D. Wyznaczanie masy mokrej
- Bezpośrednio przed analizą oddechową wyznaczono masę mokrą, osuszając poszczególne wiązki włókien (1-3mg ww) na powierzchni chłonnej (papierze filtracyjnym) za pomocą pęsety, przytrzymując włókno przy powierzchni przez 5s lub do czasu całkowitego odprowadzenia wilgoci.
- Za pomocą innej powierzchni chłonnej usunięto nadmiar cieczy z pęsety.
- Wytarowano wagę i umieszczono wiązkę włókien w plastikowej łódeczce wagowej w celu pomiaru masy.
- Przeniesiono wiązkę włókien sercowych do nowej dołki z lodowatym roztworem MiR05. Wiązka włókien jest gotowa do oceny zużycia tlenu.
3. Respirometryczna analiza OXPHOS
A. Sprzęt respirometryczny
- Laboratorium wykorzystuje i zaleca dwukomorowy oksygraf z funkcją miareczkowania i wstrzykiwania (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments). Oxygraph 2-k oferuje wysokorozdzielczą respirometrię, w dużej mierze dzięki zastosowaniu sprzętu oraz oprogramowania (DatLab), które minimalizują tło instrumentalne przyczyniające się do powstawania artefaktów zużycia tlenu.
- Kalibracja oksygrafu jest niezbędnym krokiem w celu zminimalizowania zakłócających efektów instrumentalnego zużycia tlenu. Kalibracja różni się nieznacznie w zależności od modelu oksygrafu. Szczegółowe procedury znajdują się w instrukcji obsługi urządzenia.
B. Reprezentatywny protokół kontroli jakości/walidacji techniki
- Należy upewnić się, że do komór oksygrafu zawierających polarygraficzne czujniki tlenu (POS) dodano MiR05 i zapewnić odpowiedni czas na nasycenie powietrzem oraz stabilizację MiR05 w temperaturze 37°C przed umieszczeniem mysich włókien serca w komorach oksygrafu.
- Próbki włókien serca umieszcza się w mieszanym MiR05 w komorach oksygrafu. Uwaga: Należy upewnić się, że zastosowano mieszadła powlekane PVDF lub PEEK (średnica 6mm).
- Za pomocą strzykawki wypełnionej tlenem należy zwiększyć stężenie tlenu w komorach oksygrafu do poziomu 250-550uM. Należy zauważyć, że stężenie tlenu jest czynnikiem ograniczającym dla preparatów włókien permeabilizowanych nawet przy wartościach o 50% wyższych od nasycenia powietrzem6. Należy odczekać 5-10min do ustabilizowania się stężenia tlenu.
- Za pomocą mikrosstrzykawki Hamiltona 25μL należy dodać 10μL 2M glutaminianu i 5μL 80mM jabłczanu, aby uzyskać stężenie końcowe odpowiednio 10mM i 2mM. Tytrując w ten sposób, możliwe jest oznaczenie podstawowego oddychania zależnego od kompleksu I (stan 2; brak ADP). Przepływ tlenu powinien ustabilizować się w ciągu około 5min od tytrowania. Prawidłowo przygotowany materiał powinien wykazywać bardzo powtarzalny pobór tlenu w stanie 2.
- Po 2-5min stabilnego poboru tlenu, za pomocą mikrosstrzykawki Hamiltona 25μL, należy dodać 20μL 50mM ADP, aby uzyskać stężenie końcowe 5mM (nasycające), w celu wywołania maksymalnego oddychania mitochondrialnego (stan 3) przez kompleks I. Nieliczne badania wykorzystują tak wysokie stężenie ADP, jednak istotne jest, że nasycenie powyżej 90% jest osiągane jedynie przy stężeniach powyżej 5mM7.
- Po 2-5min stabilnego poboru tlenu, za pomocą mikrosstrzykawki Hamiltona 10μL, należy dodać 5μL 4mM cytochromu c, aby uzyskać stężenie końcowe 10μM, w celu analizy kontroli jakości integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM).
- Po 2-5min stabilnego poboru tlenu, za pomocą mikrosstrzykawki Hamiltona 10μL, należy dodać 1μL 4mg/ mL oligomycyny w celu zahamowania syntazy ATP. Ten etap tytrowania posłuży do walidacji nienaruszenia wewnętrznej błony mitochondrialnej.
- Po zakończeniu respirometrycznej oceny OXPHOS próbka jest zachowywana do oznaczenia suchej masy lub markerów mitochondrialnych.
- Należy usunąć MiR05 ze szklanych komór oksygrafu. Komory należy przemyć co najmniej trzy razy wodą destylowaną (ddH2O).
- Komory należy przemyć co najmniej trzy razy 10% etanolem (EtOH), aby usunąć rozpuszczalne w EtOH inhibitory, takie jak oligomycyna.
- Komory należy przemyć trzy razy 70% EtOH, przy czym ostatnie płukanie 70% EtOH powinno trwać 30min w celu sterylizacji komór oksygrafu.
- Przed dodaniem MiR05 w nowym protokole tytrowania doświadczalnego należy upewnić się, że komory zawierające POS zostały przemyte co najmniej pięć razy ddH2O.
- Tytrowania walidacyjne mogą być wykonane jako oddzielny protokół (Rysunek 2) lub mogą zostać włączone do dobrze zaplanowanego protokołu tytrowania, w zależności od celów doświadczalnych i diagnostycznych badań respirometrycznych.
4. Reprezentatywne wyniki:
Zużycie tlenu w odpowiednio przygotowanych włóknach serca myszy jest oceniane zgodnie z protokołem kontroli jakości przedstawionym na Rysunku 2. Rysunki 3-5 prezentują najczęściej spotykane przykłady nieprawidłowo przygotowanych włókien serca. Współczynnik kontroli oddychania (RCR) stanowi istotny wskaźnik w respirometrii. Parametr ten wskazuje na stopień sprzężenia między zużyciem tlenu a fosforylacją oksydacyjną. W preparatach z permeabilizowanych włókien RCR jest stosunkiem tempa oddychania w stanie 3 do stanu 2 lub alternatywnie stosunkiem stanu 3 do stanu 4 (indukowanego przez oligomycynę i/lub atraktylosydę, ATR). Ponadto RCR może służyć jako marker zapewnienia jakości i pozwala zidentyfikować zmiany w sprzężeniu wynikające z interwencji eksperymentalnych lub patologicznych5. Dobrze sprzężone permeabilizowane preparaty serca myszy dają wartość RCR w zakresie 3-6, w zależności od zastosowanego roztworu inkubacyjnego1, 8, 9.
Miareczkowanie cytochromem c służy do walidacji prawidłowości przygotowania tkanki. Cytochrom c jest białkiem zlokalizowanym w przestrzeni międzybłonastowej wewnętrznej błony mitochondrialnej10. Gdy zewnętrzna błona mitochondriów jest nienaruszona, endogenny cytochrom c pozostaje w przestrzeni międzybłonastowej, a miareczkowanie egzogennym cytochromem c ma pomijalny wpływ na oddychanie (Rysunek 2). Jeśli zewnętrzna błona mitochondriów jest uszkodzona, endogenny cytochrom c może zostać uwolniony z przestrzeni międzybłonastowej i będzie hamował oddychanie aż do dodania egzogennego cytochromu c (Rysunek 3). W prawidłowo przygotowanych preparatach po dodaniu cytochromu c powinien wystąpić jedynie niewielki wzrost strumienia tlenu w zakresie 5-15%5. Ponadto ta eksperymentalna miareczkowanie pozwala na ocenę wpływu czynnika stresogennego, patologicznego lub eksperymentalnego, na szczelność zewnętrznej błony mitochondrialnej. W przypadku wystąpienia efektu cytochromu c należy zachować większą ostrożność podczas mechanicznego przygotowania tkanki i/lub zmniejszyć stężenie saponiny.
Dodatek oligomycyny i/lub ATR służy do oceny zmian w respiracji przeciekowej; spożycia tlenu, które nie przyczynia się do fosforylacji ADP1. Ponadto ten etap miareczkowania może być wykorzystany do walidacji prawidłowego przygotowania próbek. Włókna kontrolne lub typu dzikiego powinny być wrażliwe na ten dodatek, co objawi się znacznym spadkiem przepływu tlenu. Niski RCR oraz zmniejszona wrażliwość na oligomycynę i/lub ATR, skutkujące stosunkowo podwyższonym przepływem tlenu, wskazują na uszkodzenie wewnętrznej błony mitochondrialnej podczas przygotowania (Rysunek 4). Uszkodzenie to jest prawdopodobnie wywołane podczas mechanicznej separacji włókien serca, ponieważ wewnętrzna błona mitochondrialna jest mniej podatna na działanie saponiny w porównaniu z zewnętrzną błoną mitochondrialną. Niemniej jednak zarówno przygotowanie mechaniczne, jak i chemiczne może wymagać odpowiedniej korekty, aby uniknąć nieprawidłowego przygotowania włókien serca5, 12.
Wiązki włókien mysich z usuniętą saponiną nie powinny pozostawać w roztworze RP przez więcej niż 6h ani w roztworze MiR05 przez więcej niż 2h. Brak odpowiedzi na miareczkowanie substratowo-inhibitorowo-odsprzęgające, widoczny na rysunku 5, może wskazywać na zbyt długi czas inkubacji. W kolejnych próbach należy zminimalizować odstęp czasu między uśmierceniem zwierząt a pomiarami zużycia tlenu.
Rysunek 1. Mechaniczne przygotowanie wiązek włókien mięśniowych serca myszy. A. Całe serce bezpośrednio po sekcji. B. Próbka przedniej części lewej komory o masie 10–25 mg. C. Tkanka serca podzielona na paski o średnicy 1 mm i długości 2–4 mm. D. Końcowe wiązki włókien mięśniowych serca gotowe do chemicznej permeabilizacji saponiną.
Rycina 2. Reprezentatywne wyniki prawidłowego przygotowania tkanek z wykorzystaniem oceny polargraficznej. Przepływ tlenu w stanie 2 jest podtrzymywany przez substraty kompleksu I – glutaminian i jabłczan (M/G) i ulega znacznemu pobudzeniu po dodaniu ADP (stan 3). Brak efektu stymulującego po dodaniu egzogennego cytochromu c wskazuje na nienaruszoną zewnętrzną błonę mitochondrialną. Wrażliwość zużycia tlenu na oligomycynę sugeruje zachowanie integralności wewnętrznej błony mitochondrialnej. Stężenie tlenu w zamkniętej komorze o objętości 2 ml zaznaczono linią niebieską. Zużycie tlenu przez próbkę tkanki serca w zamkniętej komorze o objętości 2 ml reprezentuje linia czerwona. Jabłczan i glutaminian, M/G; adenozynodifosforan, ADP; cytochrom c, Cyto c; oligomycyna, o.
Rysunek 3. Test walidacji efektu cytochromu c z wykorzystaniem pomiaru polaro-graficznego. Przepływ tlenu w stanie 2 jest podtrzymywany przez substraty kompleksu I: glutaminian i jabłczan (M/G) i ulega znacznemu stymulowaniu po dodaniu ADP (stan 3). Efekt stymulujący po dodaniu egzogennego cytochromu c wskazuje na naruszenie integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Stężenie tlenu w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest oznaczone linią niebieską. Zużycie tlenu przez próbkę tkanki serca w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest reprezentowane przez linię czerwoną. Jabłczan i glutaminian, M/G; adenylo-difosforan, ADP; cytochrom c, Cyto c.
Rycina 4. Test walidacji integralności wewnętrznej błony mitochondrialnej z wykorzystaniem oceny polargraficznej. Przepływ tlenu w stanie 2 jest podtrzymywany przez substraty kompleksu I: glutaminian i jabłczan (M/G), a po dodaniu ADP następuje stosunkowo słaba stymulacja zużycia tlenu (stan 3). Niska wrażliwość zużycia tlenu na oligomycynę sugeruje uszkodzenie wewnętrznej błony mitochondrialnej. Stężenie tlenu w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest oznaczone linią niebieską. Zużycie tlenu przez próbkę tkanki serca w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest reprezentowane przez linię czerwoną. Jabłczan i glutaminian, M/G; adenozynodifosforan, ADP; oligomycyna, o.
Rycina 5. Ocena polargraficzna po przedłużonej inkubacji w MiR05. Zużycie tlenu jest niewrażliwe na egzogennąy dodatek glutaminianu i jabłczanu (M/G), a zużycie tlenu po dodaniu ADP (stan 3) jest obniżone. Nie obserwuje się efektu stymulującego po dodaniu egzogennego cytochromu c oraz stwierdza się niewrażliwość zużycia tlenu na oligomycynę. Brak odpowiedzi na dodatki do pozamitochondrialnego roztworu inkubacyjnego sugeruje upośledzenie stabilności funkcjonalnej mitochondriów. Stężenie tlenu w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest oznaczone linią niebieską. Zużycie tlenu przez próbkę tkanki serca w zamkniętej komorze o objętości 2 ml jest przedstawione linią czerwoną. Jabłczan i glutaminian, M/G; adenylofosforan, ADP; cytochrom c, Cyto c.
1. Uwagi: Przygotowanie odczynników
Przygotowanie roztworu zapasowego K2EGTA 100mM
| Nazwa odczynnika | Stężenie końcowe (mM) | g/10 ml H2O |
| glikol etylenowy-bis-(2-aminoetyleter)-N,N,N',Nkwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA) | 100 | 3.805 |
| wodorotlenek potasu (KOH) | 200 | 1.15 |
Uwaga: Dostosuj pH do wartości 7,4 w temperaturze pokojowej.
Przygotowanie 10mM roztworu zapasu Ca2EGTA
| Nazwa odczynnika | Stężenie końcowe (mM) | g/10 mL H2O | Uwagi (opcjonalnie) |
| Kwas etylenoglikol-bis-(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy (EGTA) | 10 | 3.805 | Podgrzać do 80°C i delikatnie mieszać. |
| Węglan wapnia (CaCO3) | 10 | 1.01 | Stężenie wapnia musi być precyzyjne, ponieważ wapń reguluje funkcje różnych organelli, w tym mitochondriów. Należy zapewnić całkowite rozpuszczenie całego CaCO3. Roztwór końcowy musi być całkowicie przezroczysty. CaCO3 miesza się początkowo z EGTA i niewielką ilością wody, aby aktywować tworzenie kwasu węglowego i odparowanie CO2. Reakcję tę można przyspieszyć, podgrzewając do 80 °C. |
| Wodorotlenek potasu (KOH) | 20 | 1.15 | Zneutralizować KOH po całkowitym odparowaniu CO2. |
Uwaga: Dostosować pH do 7.4 w temperaturze pokojowej.
Przygotowanie roztworu do relaksacji i konserwacji (roztwór RP)1
| Odczynnik | Stężenie końcowe (mM) | Na litr | Komentarze |
| K2EGTA | 7.23 | 72,3 ml | |
| CaK2EGTA | 2.77 | 27,7 ml | |
| Imidazol | 20 | 1,36 g | |
| Ditiotreitol | 0.5 | ||
| Tauryna | 20 | 2,52 g | |
| Sódowa sól adenozynotrifosforanu (ATP), hydrat | 5.7 | 3,14 g | |
| Fosfokreatyna (PCr) | 14.3 | 4,0 g | |
| Chlorek magnezu (MgCl2)2) | 6.56 | 0,624 g | |
| K-MES | 50 | 14,0 g |
Uwaga: Dostosuj pH do 7.1 w temperaturze pokojowej
Przygotowanie roztworu do respirometrii mitochondrialnej (roztwór MiR05)2
| Odczynnik | Stężenie końcowe (mM) | na litr | Komentarze (opcjonalnie) |
| glikol etylenowy-bis-(2-aminoetyleter)-N,N,N',Nkwas etylenodiaminotetraoctowy (EGTA) | 0.5 | 0,190 g | Stosowany jako chelator wapnia |
| Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2·6H2O)2.6H2O) | 3.0 | 0,610 g | Jakości przygotowania włókien nie można sprawdzić bez udziału Mg2+. |
| Tauryna | 20.0 | 2,502 g | Tauryna jest stabilizatorem błon oraz antyoksydantem. W sercu jej wewnątrzkomórkowe stężenie wynosi 20 mM. |
| Wodorofosforan potasu (KH2PO4) | 10.0 | 1,361 g | |
| HEPES | 20.0 | 4,7 g | |
| laktobionian potasu | 60.0 | 120 ml 0,5 M K-laktobionian roztwór zapasowy | Roztwór zapasu 0,5 M laktobionianu potasu: dodać 35,83 g kwasu laktobionowego do 10 mL H2O2do pH 7,0 w temperaturze pokojowej. Uzupełnić objętość do 20 ml wodą ddH2O. Służy do odtworzenia wysokiego wewnątrzkomórkowego stężenia K++ stężenie. Wcześniej stosowano KCl, jednak wysokie stężenie Cl- hamuje aktywność mitochondrialnej kinazy kreatynowej. |
| Sacharoza | 110.0 | 37,65 g | Stosowany jako pochłaniacz wolnych rodników tlenowych (ROS). |
| albumina surowicy bydlęcej (BSA) | 1 g/L | 1 g | Stosowany jako stabilizator błon, przeciwutleniacz oraz chelator wapnia i wolnych kwasów tłuszczowych. |
Uwaga: Dostosuj pH do 7.1 w temperaturze 30°C
3. Uwagi: Analiza respirometryczna OXPHOS
B. Wybór substratów, odsprzęgaczy i inhibitorów
Lista wybranych substratów do analizy respirometrii mitochondrialnej
| Substrat | [Stężenie zapasu] | Przygotowanie | Objętość na 2 mL | [Stężenie końcowe] | Uwagi |
| Sól monopotasowa dwuwodniana 5'-difosforanu adenozy (ADP) | 50mM | 246mg/ mL ddH2O. Dostosować pH do 7,1 w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze -80°C w alikwotach 250 μL. | 20ul | 5mM | Aby utrzymać stałe stężenie Mg2+ podczas eksperymentów respirometrycznych, dodać 0,6 mol MgCl2/mol ADP. |
| Kwas askorbinowy | 80mM | 0,1584g/ mL ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 200 μL. Czuły na światło. | 5 μL | 2mM | Działa jako substrat przy jednoczesnym zastosowaniu TMPD. Należy skorygować przepływ tlenu o autooksydację. |
| Cytochrom C | 4mM | 50mg/ mL ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 250 μL. | 5 μL | 10uM | |
| Cyjanek karbonylowy p-(trifluorometoksy) fenylhydrazona (FCCP) | 0,1mM | 0,254mg/10 mL 10% EtOH. Przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -20°C w alikwotach 50 μL. | Kroki po 1 μL | Działa jako odsprzęgacz. Pozwala określić maksymalną wydajność transportu elektronów oraz wszelkie ograniczenia transportu elektronów przez system fosforylacji. | |
| Glutaminian | 2M | 0,3742g/ mL ddH2O. Dostosować pH do 7,1 w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 250 μL. | 10ul | 10mM | Działa jako substrat dla dehydrogenazy NADH (kompleks I). |
| Malonian | 80mM | 0,1073g/ mL ddH2O. Dostosować pH do 7,1 w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 250 μL. | 5ul | 2mM | Działa jako substrat dla dehydrogenazy NADH (kompleks I). Sam nie podtrzymuje oddychania. |
| Pirowinian | 1M | 11mg/0,1 mL ddH2O. Przygotować na świeżo. | 5 μL | 2,5mM | Działa jako substrat dla dehydrogenazy NADH (kompleks I). |
| Bursztynian | 10mM | 1,3505g/5 mL ddH2O. Dostosować pH do 7,1 w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 250 μL. | 20ul | 10mM | Działa jako substrat dla dehydrogenazy bursztynianowej (kompleks II). |
| N,N,N',N'-tetrametylo- p-fenylenodiamina dihydrochlorek (TMPD) | 20mM | 47,1mg/ mL ddH2O. Dodać askorbinian 0,8M do stężenia końcowego 10mM, aby zapobiec autooksydacji. Przechowywać w temperaturze -20°C w alikwotach 200 μL. | 5 μL | 0,5mM | Autooksydację roztworu zapasowego objawia pojawienie się niebieskiego zabarwienia. Działa jako substrat przy jednoczesnym zastosowaniu TMPD. Należy skorygować przepływ tlenu o autooksydację. |
Lista wybranych inhibitorów do analizy respirometrii mitochondrialnej
| Substrat | [Stężenie zapasu] | Przygotowanie | Objętość na komorę 2 mL | [Stężenie końcowe] | Uwagi |
| Antomycyna A | 5mM | 27,4mg/10 mL 10% EtOH. Przechowywać w -20°C w alikwotach 250 μL. | 1 μL | 2,5μM | Inhibitor reduktazy koenzymu Q: cytochromu c (kompleks III) |
| Atraktylosyd | 50mM | 40mg/ mL ddH2O. Przechowywać w -20°C w alikwotach 250 μL. | 30 μL | 0,75mM | Inhibitor syntazy ATP. |
| Oligomycyna | 4mg/ mL | 4mg/ mL 10% EtOH. Przechowywać w -20°C w alikwotach 20 μL. | 1 μL | Inhibitor syntazy ATP. | |
| Cyjanek potasu | 1M | 65,1mg/ mL ddH2O. Przygotować na świeżo. Dostosować pH do 7,1 w temperaturze pokojowej | 1 μL | 1mM | Inhibitor oksydazy cytochromu c (kompleks IV). Stosować po miareczkowaniu TMPD i askorbinianem w celu oceny autooksydacji. |
| Rotenon | 0,1mM | 0,39mg/10 mL 10% EtOH. Przechowywać w -20°C w alikwotach 250 μL. Wrażliwy na światło. | 1 μL | 0,05μM | Inhibitor dehydrogenazy NADH (kompleks I). Może być wymagane zastosowanie wyższych stężeń, jednak aby zmniejszyć retencję rotenonu w komorze, należy rozpocząć zgodnie z opisem. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika włókien sercowych permeabilizowanych saponiną oferuje unikalny kompromis między oceną konsumpcji tlenu w procesie OXPHOS mitochondriów in vitro a in vivo. Zalety tej techniki obejmują zwiększoną istotność fizjologiczną w porównaniu do izolowanych mitochondriów, ponieważ zachowana zostaje architektura komórkowa. Podczas gdy błona plazmatyczna ulega degradacji, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, w tym mitochondria12, 14, siateczka sarkoplazmatyczna14, miofilamenty i cytosz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe na wynagrodzenie z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Laboratorium pragnie podziękować firmie Oroboros Instruments za pomoc techniczną podczas wdrażania techniki z wykorzystaniem włókien przepuszczalnych dla saponin.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% etanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenozyna 5′-dwuwodnian srebrowytlenek potasu ADP (fosforan dwuodstrojowy, sól monopotasowa, dwuwodzian) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albuminy z surowicy bydlęcej, kwasy tłuszczowe niezbędne–bezpłatny | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antymycyna A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenozyna 5′uwodniona sól disodowa trifosforanu adenozyny (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractylosyd | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Węglan wapnia | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Karbonylocyjanek p-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| glikol etylenowy-bis-(2-amino–thylether)-N,N,N′,N′-kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Kwas glutaminowy | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamina | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Kwas laktobionowy | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2)2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| chlorek magnezu sześciowodny (MgCl₂·6H₂O)2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Kwas jabłkowy | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-dihydrochlorowodorek tetrametylop-fenylenediamine (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycyna | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Fosfokreatyna | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Wodorotlenek potasu | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Cyjank potasu | Fluka | 60178 | |
| Wodny wodorofosforan potasu | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Pentobarbital sodu | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Stęż. 54,7 mg/ml |
| Pirowinian sodu | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Kwas bursztynowy | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tauryna | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Ksylazyna | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O2O | |||
| Lód | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml | VWR international | 89004-368 | |
| probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml | VWR international | 89004-364 | |
| Proste pęsety jubilerskie | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Zakrzywiona pęseta jubilerska | George Tiemann &i Spółka | 160-57B | |
| Proste nożyce chirurgiczne | George Tiemann &i Spółka | 105-402 | |
| Sterylny skalpel chirurgiczny | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μFiltry strzykawkowe | VWR international | CA28145-485 | |
| pH-metr | VWR international | CA11388-308 | |
| Szklane szalki Petriego | VWR international | 89000-300 | |
| polistyrenowe płytki hodowlane z 12 dołkami | VWR International | 82050-926 | |
| Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem | VWR international | 97042-594 | |
| Microbars Fisherbrand | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Waga laboratoryjna | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μmikrosyringa Hamilton | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μmikrosstrzykawka Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μmikrostrzykawka Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Butelki do wyciskania Nalgene | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polistyrenowe naczynia wagowe | VWR international | 89106-750 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus Corporation |
Bibliografia
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
