Przygotowanie włókien permeabilizowanych saponiną w połączeniu z respirometryczną analizą fosforylacji oksydacyjnej umożliwia zintegrowaną ocenę funkcji mitochondriów. Oddychanie mitochondrialne w stanach fizjologicznych i patologicznych może odzwierciedlać różne wpływy regulacyjne, w tym oddziaływania mitochondrialne, morfologię oraz biochemikę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena fosforylacji oksydacyjnej metodą respirometryczną w włóknach mięśnia sercowego permeabilizowanych saponiną
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie funkcji mitochondriów stanowi istotny parametr fizjologii serca, ponieważ mitochondria biorą udział w metabolizmie energetycznym, stresie oksydacyjnym, apoptozie, starzeniu się organizmu, encefalomiopatiach mitochondrialnych oraz toksyczności leków. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na technologie pozwalające mierzyć funkcje mitochondriów w sercu. Jedną z technik wykorzystujących podejście integracyjne do pomiaru funkcji mitochondrialnych jest respirometryczna analiza fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS).
Zasada oceny OXPHOS metodą respirometryczną opiera się na pomiarze stężenia tlenu przy użyciu elektrody Clarka. W miarę jak permeabilizowany pęczek włókien zużywa tlen, jego stężenie w zamkniętej komorze spada. Dzięki zastosowaniu wybranych protokołów miareczkowania substratami, inhibitorami i odsprzęgaczami, elektrony są dostarczane do konkretnych miejsc łańcucha transportu elektronów, co umożliwia ocenę funkcji mitochondriów. Przed analizą respirometryczną funkcji mitochondrialnych stosuje się mechaniczne i chemiczne techniki przygotowawcze w celu permeabilizacji sarkolemmy włókien mięśniowych. Permeabilizacja chemiczna wykorzystuje saponinę do selektywnego perforowania błony komórkowej przy zachowaniu architektury komórkowej.
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje etapy przygotowania włókien sercowych pozbawionych błon komórkowych za pomocą saponiny do pomiarów zużycia tlenu w celu oceny mitochondrialnego OXPHOS. Ponadto przedstawiono wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, a także określone substraty, inhibitory i odsprzęgacze, które mogą być wykorzystane do określenia funkcji mitochondriów w konkretnych miejscach łańcucha transportu elektronów. Co istotne, opisany protokół można łatwo zastosować do tkanek serca i mięśni szkieletowych różnych modeli zwierzęcych oraz próbek ludzkich.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Roztwór do relaksacji i konserwacji (roztwór RP) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem z niewielkimi modyfikacjami1. W skrócie, roztwór RP składa się z 2.77mM CaK2EGTA, 7.23mM K2EGTA, 20mM imidazolu, 0.5mM ditiotreitolu, 20mM tauryny, 50mM K-MES, 6.56 MgCl2, 5.7mM ATP, 14.3mM fosfokreatyny, pH 7.1, dostosowane w temperaturze pokojowej (RT). Przefiltrować roztwór przez filtr 0.45-μm w celu sterylizacji. Rozdzielić na porcje po 15 mL (polipropylenowe probówki Falcon) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przepisy znajdują się w części dyskusyjnej.
- Roztwór do respiromet....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Technika włókien sercowych permeabilizowanych saponiną oferuje unikalny kompromis między oceną konsumpcji tlenu w procesie OXPHOS mitochondriów in vitro a in vivo. Zalety tej techniki obejmują zwiększoną istotność fizjologiczną w porównaniu do izolowanych mitochondriów, ponieważ zachowana zostaje architektura komórkowa. Podczas gdy błona plazmatyczna ulega degradacji, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, w tym mitochondria12, 14, siateczka sarkoplazmatyczna14, miofilamenty i cytosz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe na wynagrodzenie z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Laboratorium pragnie podziękować firmie Oroboros Instruments za pomoc techniczną podczas wdrażania techniki z wykorzystaniem włókien przepuszczalnych dla saponin.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% etanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenozyna 5′-dwuwodnian srebrowytlenek potasu ADP (fosforan dwuodstrojowy, sól monopotasowa, dwuwodzian) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albuminy z surowicy bydlęcej, kwasy tłuszczowe niezbędne–bezpłatny | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antymycyna A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Kwas askorbinowy | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenozyna 5′uwodniona sól disodowa trifosforanu adenozyny (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractylosyd | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Węglan wapnia | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Karbonylocyjanek p-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrom c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| glikol etylenowy-bis-(2-amino–thylether)-N,N,N′,N′-kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Kwas glutaminowy | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamina | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Kwas laktobionowy | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2)2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| chlorek magnezu sześciowodny (MgCl₂·6H₂O)2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Kwas jabłkowy | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-dihydrochlorowodorek tetrametylop-fenylenediamine (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycyna | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Fosfokreatyna | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Wodorotlenek potasu | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Cyjank potasu | Fluka | 60178 | |
| Wodny wodorofosforan potasu | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Pentobarbital sodu | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Stęż. 54,7 mg/ml |
| Pirowinian sodu | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Kwas bursztynowy | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sacharoza | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tauryna | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Ksylazyna | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O2O | |||
| Lód | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 15 ml | VWR international | 89004-368 | |
| probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml | VWR international | 89004-364 | |
| Proste pęsety jubilerskie | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Zakrzywiona pęseta jubilerska | George Tiemann &i Spółka | 160-57B | |
| Proste nożyce chirurgiczne | George Tiemann &i Spółka | 105-402 | |
| Sterylny skalpel chirurgiczny | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μFiltry strzykawkowe | VWR international | CA28145-485 | |
| pH-metr | VWR international | CA11388-308 | |
| Szklane szalki Petriego | VWR international | 89000-300 | |
| polistyrenowe płytki hodowlane z 12 dołkami | VWR International | 82050-926 | |
| Mieszadło magnetyczne z podgrzewaniem | VWR international | 97042-594 | |
| Microbars Fisherbrand | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Waga laboratoryjna | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μmikrosyringa Hamilton | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μmikrosstrzykawka Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μmikrostrzykawka Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Butelki do wyciskania Nalgene | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polistyrenowe naczynia wagowe | VWR international | 89106-750 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus Corporation |
Bibliografia
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , S....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
