Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro
407 wyświetleń
⸱
30 stycznia 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Fagocytoza wywołana przez FcγR- i CR
- Do opsonizacji inkubuj 2 x 10 8 owczych czerwonych krwinek (SRBC) z 50 μL króliczego anty-SRBC-IgM lub 50 μL króliczego anty-SRBC-IgG przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Inkubować SRBC opsonizowane przez IgM-opsonizację z 50 μL surowicy ludzkiej niedoborowej C5 (C5D) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby utrwalić fragmenty dopełnienia C3b i C3bi na SRBC pokrytych IgM.
- Nasiać komórki makrofagów myszy (komórki MH-S) (10 000 komórek/dołek) w płycie z 96 dołkami i inkubować przez noc, aby uzyskać ~70% konfluencję. Dodaj 100 μL 100 μL 1 x 10 7/mL opsonowanych SRBC do każdego dołka komórek MH-S i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bardzo szybko (~1 min) płucz rozzwiązane SRBC 100 μL buforu lizy chlorku amonu i potasu (ACK).
- Limfatyka należy zawierać 0,1% SDS i dodać 50 μL 2,7-diaminofluorenu (DAF) zawierającego 3% nadtlenku wodoru i 6 mg mocznika. Zmierz absorpcję formacji fluorenu niebieskiego katalyzowanego hemoglobiną na 620 nm.
- Określ liczbę SRBC, używając standardowej krzywej o wartości absorpcji 620 nm i znanej liczbie SRBC. Podobnie komórki procesowe MH-S inkubowane z nieopsonizowanymi SRBC do wykorzystania jako negatywna kontrola.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2,7-diaminofluoren (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Stopień z biologii molekularnej |
| 70% etanolu | Decon Labs Inc. | 18C27B | Poziom analityczny |
| Płyta z 96 dołami | Corning | 3603 | Stopień z biologii komórki |
| Bufor lizy ACK | Technologie życia | A10492 | Stopień z biologii molekularnej |
| Surowica z niedoborem C5 | Sigma-Aldrich | C1163 | Odczynnik biochemiczny |
| Wirówka | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuga | Thermofisher Scientific | A78300101 Numer 11 | |
| Medii do hodowli komórek DMEM | Gibco | 11995-065 | Stopień z biologii komórki |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Stopień z biologii komórki |
| Cytometr przepływowy | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Oprogramowanie Flow Jo | FlowJo, LLC | ||
| Kleszcze | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Odpowiedni do sekcji zwierząt laboratoryjnych |
| Szklana miska na dnie | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Stopień z biologii komórki |
| Strzykawka wysokociśnieniowa | Penn-Century | FMJ-250 | Odpowiedni do użytku w zwierzętach laboratoryjnych |
| Homogenizator | Omni International | TH-01 | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma-Aldrich | H1009 | Poziom analityczny |
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | Olympus | IX73 | |
| MikroSpryskiwacz | Penn-Century | IA-1C | Odpowiedni do użytku w zwierzętach laboratoryjnych |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Stopień odczynnikowy |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Stopień z biologii komórki |
| rabbit anty-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Odpowiednie do testów immunologicznych |
| królicze anty-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Odpowiednie do testów immunologicznych |
| Nożyczki | Miltex | 5-2 | Odpowiedni do sekcji zwierząt laboratoryjnych |
| owce czerwone krwinki (SRBC) | MP Biomedicals | 55876 | Oczyszczone, zachowane SRBC |
