Modelowanie fagocytozy podleganej komplementem za pomocą opsonizowanych czerwonych krwinek in vitro

Abstract

Źródło: Nagre, N. i inni. Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i usuwanie bakterii u myszy. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje ocenę fagocytozy pośredniczonej przez receptory komplementacyjne przy użyciu czerwonych krwinek owiec opsonowanych IgM i dopełniakiem, a następnie ich przyjmowania przez mysie makrofagi. Zakres fagocytozy mierzy się poprzez pomiar niebieskiego produktu chromogenicznego powstałego w wyniku katalyzowanej przez hemoglobinę utleniania diaminofluorenu.

Protocol

1. Fagocytoza wywołana przez FcγR- i CR

1. Do opsonizacji inkubuj 2 x 10 8 owczych czerwonych krwinek (SRBC) z 50 μL króliczego anty-SRBC-IgM lub 50 μL króliczego anty-SRBC-IgG przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Inkubować SRBC opsonizowane przez IgM-opsonizację z 50 μL surowicy ludzkiej niedoborowej C5 (C5D) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby utrwalić fragmenty dopełnienia C3b i C3bi na SRBC pokrytych IgM.
3. Nasiać komórki makrofagów myszy (komórki MH-S) (10 000 komórek/dołek) w płycie z 96 dołkami i inkubować przez noc, aby uzyskać ~70% konfluencję. Dodaj 100 μL 100 μL 1 x 10 7/mL opsonowanych SRBC do każdego dołka komórek MH-S i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bardzo szybko (~1 min) płucz rozzwiązane SRBC 100 μL buforu lizy chlorku amonu i potasu (ACK).
4. Limfatyka należy zawierać 0,1% SDS i dodać 50 μL 2,7-diaminofluorenu (DAF) zawierającego 3% nadtlenku wodoru i 6 mg mocznika. Zmierz absorpcję formacji fluorenu niebieskiego katalyzowanego hemoglobiną na 620 nm.
5. Określ liczbę SRBC, używając standardowej krzywej o wartości absorpcji 620 nm i znanej liczbie SRBC. Podobnie komórki procesowe MH-S inkubowane z nieopsonizowanymi SRBC do wykorzystania jako negatywna kontrola.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,7-diaminofluoren (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Stopień z biologii molekularnej
70% etanolu	Decon Labs Inc.	18C27B	Poziom analityczny
Płyta z 96 dołami	Corning	3603	Stopień z biologii komórki
Bufor lizy ACK	Technologie życia	A10492	Stopień z biologii molekularnej
Surowica z niedoborem C5	Sigma-Aldrich	C1163	Odczynnik biochemiczny
Wirówka	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuga	Thermofisher Scientific	A78300101 Numer 11
Medii do hodowli komórek DMEM	Gibco	11995-065	Stopień z biologii komórki
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Stopień z biologii komórki
Cytometr przepływowy	BD Biosciences	FACSCalibur
Oprogramowanie Flow Jo	FlowJo, LLC
Kleszcze	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Odpowiedni do sekcji zwierząt laboratoryjnych
Szklana miska na dnie	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Stopień z biologii komórki
Strzykawka wysokociśnieniowa	Penn-Century	FMJ-250	Odpowiedni do użytku w zwierzętach laboratoryjnych
Homogenizator	Omni International	TH-01
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	H1009	Poziom analityczny
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olympus	IX73
MikroSpryskiwacz	Penn-Century	IA-1C	Odpowiedni do użytku w zwierzętach laboratoryjnych
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Stopień odczynnikowy
PBS	Gibco	20012-027	Stopień z biologii komórki
rabbit anty-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Odpowiednie do testów immunologicznych
królicze anty-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Odpowiednie do testów immunologicznych
Nożyczki	Miltex	5-2	Odpowiedni do sekcji zwierząt laboratoryjnych
owce czerwone krwinki (SRBC)	MP Biomedicals	55876	Oczyszczone, zachowane SRBC