Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny jest „złotym standardem” w ocenie działania insuliny. Insulinę podaje się w stałym tempie, co stymuluje wychwyt glukozy. Ilość egzogennej glukozy podawanej w celu przeciwdziałania temu spadkowi jest wskaźnikiem wrażliwości na insulinę. W niniejszym materiale procedura jest przeprowadzana na przytomnym, nieskrępowanym szczurze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny u świadłego szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Częstość występowania cukrzycy typu 2 (T2D) gwałtownie rośnie. Charakteryzująca się albo niewystarczającą produkcją insuliny, albo niezdolnością do wykorzystania produkowanej insuliny, T2D prowadzi do podwyższonego poziomu glukozy we krwi. „Złotym standardem” w ocenie wrażliwości na insulinę jest zacisk hiperinsulinemiczno-euglikemiczny (hyperinsulinemic-euglycemic clamp) lub zacisk insulinowy. W tej procedurze insulinę infunduje się ze stałą prędkością, co skutkuje spadkiem poziomu glukozy we krwi. Aby utrzymać poziom glukozy we krwi na stałym poziomie, do krążenia żylnego infunduje się egzogenną glukozę (D50). Ilość glukozy infundowanej w celu utrzymania homeostazy jest wskaźnikiem wrażliwości na insulinę. W niniejszym materiale przedstawiamy podstawową procedurę zacisku u szczura z chronicznie wszczepionymi cewnikami, nieunieruchomionego i świadomego. Model ten pozwala na pobieranie krwi przy minimalnym stresie dla zwierzęcia. Po wprowadzeniu znieczulenia wykonuje się cięcie w linii środkowej, a następnie cewnikuje się lewą wspólną tętnicę szyjną i prawą żyłę szyjną. Wprowadzone cewniki płucze się solą fizjologiczną z heparyną, a następnie wyprowadza na zewnątrz i mocuje. Zwierzętom pozwala się na rekonwalescencję przez 4-5 dni przed rozpoczęciem eksperymentów, przy codziennym monitorowaniu przyrostu masy ciała. Do eksperymentów wykorzystuje się wyłącznie te zwierzęta, których masa ciała powróciła do poziomu sprzed operacji. W dniu eksperymentu szczury są głodzone i podłączone do pomp zawierających insulinę oraz D50. Poziom glukozy wyjściowy jest oceniany z linii tętniczej i służy jako punkt odniesienia w trakcie całego eksperymentu (euglikemia). Następnie insulinę infunduje się ze stałą prędkością do krążenia żylnego. Aby zrównoważyć spadek poziomu glukozy we krwi, infunduje się D50. Jeśli szybkość infuzji D50 jest większa niż szybkość poboru, nastąpi wzrost poziomu glukozy. Podobnie, jeśli szybkość jest niewystarczająca, aby zrównoważyć pobór glukozy przez cały organizm, nastąpi spadek. Miareczkowanie glukozy trwa do momentu uzyskania stabilnych odczytów poziomu glukozy. Poziomy glukozy oraz szybkości infuzji glukozy w tym stabilnym okresie są rejestrowane i raportowane. Wyniki stanowią indeks ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę. Technikę tę można doprecyzować, aby sprostać konkretnym wymaganiom eksperymentalnym. Można ją dodatkowo usprawnić poprzez zastosowanie znaczników radioaktywnych, które pozwalają określić stymulowany insuliną pobór glukozy w konkretnych tkankach, a także ogólnoustrojowy obrót glukozy.
Protokół
A: Chirurgiczna kaniulacja krążenia tętniczego i żylnego
Część 1: Przygotowanie cewników tętniczych i żylnych
- Odciąć 15 cm rurki PE-50 (średnica wewnętrzna 0,58 mm (0,023") x średnica zewnętrzna 0,965 mm (0,038")). Odciąć odcinek 1 mm rurki silastycznej (średnica wewnętrzna 0,76 mm (0,030") x średnica zewnętrzna 1,65 mm (0,065")), który posłuży jako koralik mocujący. Koralik mocujący zapobiega wysunięciu się cewnika przez szczura po jego umieszczeniu.
- Wprowadzić końcówki pęsety mikrochirurgicznej do światła koralika mocującego i delikatnie rozsunąć końcówki pęsety, aby rozszerzyć otwór. Używając drugiej pęsety mikrochirurgicznej, wsunąć rurkę silastyczną do światła koralika mocującego. Przymocować za pomocą mocnego kleju (Loctite Super Glue). Koralik musi ściśle przylegać do cewnika. Pozostawić cewnik do wyschnięcia (24 h).
- Dla szczura o masie 30 g linia tętnicza ma długość ~2,7 cm od koralika mocującego, natomiast linia jagłyczna ~3,2 cm. Długość cewników od koralika mocującego koryguje się o 0,5 cm na każde 100 g wzrostu masy ciała. Nie należy ściinać krawędzi cewnika, ponieważ może to spowodować przebicie naczynia podczas wprowadzania.
- Bezpośrednio przed operacją wypełnić linie soli fizjologicznej z heparyną (10 U/ml), uszczelnić oba końce stalowym korkiem do rurek i umieścić w etanolu (70%) w celu sterylizacji. Przed wprowadzeniem wysuszyć na powietrzu.
Część 2: Przygotowanie chirurgiczne
- Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych w zakresie przeprowadzania doświadczeń. Opisane poniżej procedury wykonano na dorosłych, samcach szczurów rasy Sprague-Dawley (~30g). Wszystkie zabiegi przeprowadzano w znieczuleniu izofluranem, choć możliwe jest zastosowanie środków znieczulających dożylnie. Wszystkie procedury chirurgiczne wykonuje się z zachowaniem technik aseptycznych. Sprzęt chirurgiczny, zlewki oraz sól fizjologiczna z heparyną są sterylizowane w autoklawie. Rękawice chirurgiczne, strzykawki i aplikatory z bawełnianym końcem są kupowane w formie sterylnej od dostawcy.
- Zważ szczura i zapisz wynik. Masa ciała będzie istotna podczas monitorowania zwierząt po operacji. Do doświadczeń należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta, które odzyskały masę ciała sprzed zabiegu. Znieczul szczura (3% izofluranu) w komorze znieczulającej. Podczas operacji utrzymuj stężenie izofluranu na poziomie ~2% przy użyciu maski nosowej. Operację należy przeprowadzić w zdezynfekowanym obszarze sprzyjającym zachowaniu aseptyki.
- Przygotuj zwierzę, usuwając owłosienie z miejsca operacyjnego (szyja i łopatki). Można użyć małej maszynki do strzyżenia lub chemicznego depilatora. Procedurę tę należy wykonać w miejscu oddzielonym od obszaru, w którym przeprowadzana będzie operacja.
- Ustabilizuj zwierzę na stole chirurgicznym. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, sprawdzając obecność odruchów stopy/oka. Przygotuj miejsce operacyjne, stosując odpowiedni środek do dezynfekcji skóry (70% etanol, następnie betadyna, a na koniec ponownie 70% etanol).
Część 3: Operacja
- Wykonaj niewielkie pionowe nacięcie w linii środkowej, 1 cm powyżej mostka (uchwyć skórę wzdłuż osi przyśrodkowej pęsetą i przetnij nożyczkami lub skalpelem).
- Wykonaj tępe rozczłonkowanie za pomocą mikro pęsety chirurgicznej, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Odsunij ten mięsień, aby odsłonić około 1 cm lewej tętnicy szyjnej. Użyj mikro pęsety chirurgicznej pod tętnicą szyjną, aby utrzymać naczynie w miejscu. Delikatnie oddziel tkankę łączną od tętnicy szyjnej. Ważne jest odizolowanie nerwu błędnego od tętnicy bez uszkodzenia ani naczynia, ani nerwu. Odizoluj tętnicę, a następnie podwiąż jej koniec głowowy szwem jedwabnym 4-0 (posłuży on do manipulowania tętnicą szyjną podczas operacji). Uwaga: szwy 4-0 powinny zostać wysterylizowane 70% etanolem przed użyciem.
- Zaciśnij naczynie ząbkowaną mikro pęsetą chirurgiczną. Przebij podwiązany koniec za pomocą adaptera Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zaślepkę rurki i ostrożnie wprowadź cewnik za pomocą sterylnego wprowadzacza cewników do wnętrza tętnicy. Trzymając cewnik pewnie pęsetą, częściowo zwolnij uścisk mikro pęsety na tętnicy i kontynuuj wprowadzanie cewnika aż do koralika. Na tym etapie końcówka cewnika powinna znajdować się w łuku aorty. Należy uważać, aby nie wypuścić cewnika, ponieważ ciśnienie w naczyniu może go wypchnąć.
- Zwiąż dwa szwy 4-0 bezpiecznie poniżej koralika oraz jeden powyżej i potwierdź możliwość poboru próbki z cewnika. Przepłucz linię solą fizjologiczną z heparyną 10U/ml. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zaślepką rurki.
- Korzystając z tego samego nacięcia, wykonaj tępe rozczłonkowanie, aby odsłonić prawą zewnętrzną żyłę szyjną. Ostrożnie odizoluj i podwiąż koniec głowowy szwem jedwabnym. Przebij żyłę adapterem Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zaślepkę rurki i wprowadź cewnik za pomocą sterylnego wprowadzacza cewników aż do koralika, a następnie zawiąż dwa szwy poniżej koralika. Zawiąż trzeci szew powyżej koralika i potwierdź możliwość poboru próbek. Przepłucz linię żylną solą fizjologiczną z heparyną 10U/mL. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zaślepką rurki.
- Przesuń tępą igłę 14G pod skórą i wykonaj nacięcie na grzbiecie pomiędzy łopatkami. Przewlecz cewniki przez igłę, aby wyprowadzić je na zewnątrz w okolicy grzbietu szczura. Widoczny powinien być odcinek linii o długości około 4 cm. Odetnij 0,5 cm rurki medycznej Tygon S-50-HL, nałóż ją na oba wyprowadzone cewniki i zabezpiecz taśmą według potrzeb (niebieską dla żyły, czerwoną dla tętnicy). Ponownie sprawdź cewniki, aby upewnić się, że są drożne, przepłucz i wypełnij solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml, aby zapobiec krzepnięciu.
- Zamknij wszystkie nacięcia szwem jedwabnym 3-0. Umieść szczura w pozycji brzusznej w podgrzanej, czystej klatce z pokarmem na dnie.
B: Opieka pooperacyjna
Część 1: Bezpośrednia opieka i monitorowanie pooperacyjne
- Gdy szczur odzyska pełną zdolność poruszania się i czujność, należy go przenieść z powrotem do klatki.
- Pozostawić szczura w celu rekonwalescencji na 3-5 dni.
- Codziennie monitorować pod kątem infekcji, bólu oraz zmian masy ciała. Podejrzenie infekcji pojawia się w przypadku zaobserwowania wydzieliny w miejscach nacięć, ogólnej letargii i/lub bólu. Ból objawia się zgarbioną postawą, zjeżoną sierścią na grzbiecie oraz brakiem aktywności ruchowej i/lub chęci jedzenia. Spadek masy ciała może wystąpić bezpośrednio po operacji, do trzech dni po zabiegu, jednak w ciągu 5 dni waga powinna się ustabilizować i/lub wzrosnąć do poziomu w granicach 10% masy przedoperacyjnej. Znaczna utrata masy ciała może wskazywać na infekcję, udar i/lub ból.
- Codziennie sprawdzać drożność cewników.
Część 2: Utrzymanie drożności cewnika
- Każdego dnia podczas rekonwalescencji pooperacyjnej napełnić strzykawki 1ml typu Slip Tip solą fizjologiczną z heparyną o stężeniu 150U/ml i zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22 G. Tępą igłę wprowadza się do 20cm rurki PE-50 z łącznikiem ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23 G na drugim końcu.
- Usunąć pęcherzyki powietrza, ustawiając koniec z łącznikiem rurek wyżej niż resztę strzykawki 1ml i wypychając pęcherzyki z przewodu.
- Zakleszczć zewnętrzną linię tętniczą szczura za pomocą kleszczyków hemostatycznych tuż poniżej korka.
- Usunąć stalowy korek cewnika za pomocą drugiej pary kleszczyków hemostatycznych.
- Wprowadzić łącznik rurek połączony ze strzykawką do linii tętniczej i zwolnić kleszczyki blokujące zewnętrzny cewnik tętniczy.
- Odessać krew tętniczą z cewnika do strzykawki. Jeśli cewnik nie pobiera krwi łatwo, może być konieczne bardzo delikatne wstrzyknięcie niewielkiej ilości roztworu płuczącego przez cewnik, aby odblokować jego końcówkę w przypadku, gdyby była ona przyciśnięta do ściany naczynia. Cewnik jest całkowicie drożny, gdy krew dotrze do strzykawki.
- Zakleszczć rurkę PE-50 blisko strzykawki 1ml i zutylizować strzykawkę. Zastąpić ją nową strzykawką wypełnioną świeżą solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml. Zwolnić zacisk rurki i, trzymając nową strzykawkę pionowo, opukać ją palcem, aby przesunąć ewentualne nowe pęcherzyki powietrza w górę i z dala od przewodu. Uwaga: Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować udar.
- Wstrzyknąć sól fizjologiczną z heparyną 150U/ml, aż linia cewnika będzie przejrzysta i wolna od krwi.
- Zakleszczć zewnętrzną linię tętniczą szczura kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej łącznika rurek. Usunąć złącze strzykawki z linii cewnika tętniczego i zastąpić je stalowym korkiem do rurek.
- Zwolnić kleszczyki blokujące zewnętrzny cewnik tętniczy.
- Powtórzyć procedurę dla linii żylnej. Jednak ze względu na niskie ciśnienie żylne pobieranie próbek często nie jest możliwe. Jeśli sól fizjologiczna z heparyną 150U/ml może być wprowadzana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest prawidłowo umieszczony w żyle.
C: Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny
Część 1: Konfiguracja i przygotowanie zacisków
- Zważ szczura i zapisz jego masę. Będzie ona niezbędna do określenia szybkości wlewów insuliny i glukozy. Głodź szczura przez co najmniej 5 h przed eksperymentem. Zapewnia to, że zwierzę znajduje się w stanie poposiłkowym, a wkład glukozy z produktów spożywczych jest zminimalizowany. Umieść szczura w małym pojemniku/klatce z podściółką, która ogranicza nadmierny ruch. Zwierzę powinno mieć możliwość swobodnego obracania się i pielęgnacji.
- Przygotuj linie i pompy infuzyjne zgodnie z Rysunkiem 1. Długości przewodów połączeniowych P50 są następujące: od strzykawki do łącznika Y wynosi 8 cm, od łącznika Y do szczura 15 cm, linia tętnicza 20 cm, a linia żylna 10 cm. Usuń stalowe korki z przewodów i przemyj linie żylną oraz tętniczą, aby zapewnić odpowiednio drożność wlewu i poboru próbek, używając soli fizjologicznej z dodatkiem heparyny w stężeniu 10U/ml.
- Określ wymaganą objętość insuliny. Będzie ona zależeć od poziomu insuliny i masy szczura. W tym przypadku dawkę 4mU/kg/min podaje się z szybkością 2uL/min. Jest to wysoka dawka fizjologiczna. W miarę możliwości należy dążyć do ograniczenia objętości wlewów. Insulinę należy odpowiednio rozcieńczyć i podawać w obecności osocza. W tym laboratorium do rozcieńczania insuliny stosuje się 3% roztwór osocza szczura w soli fizjologicznej. Stosowana insulina to HumulinR 10U/ml (Eli Lily), choć można użyć innych insulin szybkodziałających. Przed wprowadzeniem do strzykawki infuzyjnej upewnij się, że rozcieńczona insulina jest dobrze wymieszana.
- Przygotuj 50% dekstrozę. Można ją wprowadzić bezpośrednio do strzykawki w pompie infuzyjnej. Oznacz pompę napisem „glukoza”, aby uniknąć pomyłek w przyszłości. Pamiętaj o zapewnieniu wystarczających objętości insuliny i glukozy na potrzeby badania. Zaciśnięcia linii trwają zazwyczaj około 2 h. W niniejszym protokole stosowane są strzykawki o pojemności 3 ml.
- Umieść strzykawki z glukozą i insuliną w pompach strzykawkowych Harvard Apparatus Model 1 Plus. Przesuń glukozę do łącznika Y i zaciśnij linię kleszczykami hemostatycznymi. Przesuń insulinę do zwierzęcia i zaciśnij linię kleszczykami. Zaciśnij linie i pozwól szczurowi odpocząć przez 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu. UWAGA: Zaleca się stosowanie osłonek na końcówki kleszczyków, aby uniknąć trwałego zgniecenia przewodów.
- Przygotuj wirówkę oraz probówki powlekane EDTA do pobierania osocza. W niniejszym badaniu dodatkowe próbki krwi zostaną pobrane po zaciśnięciu linii u zwierzęcia.
Część 2: Protokół doświadczalny
- Należy pobrać wyjściową próbkę insuliny oraz próbkę do oznaczenia hematokrytu. Pomiar hematokrytu zapewnia utrzymanie objętości krwi w trakcie całego eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej.
- Pobierz wyjściową próbkę glukozy (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) i określ poziom glukozy w krwi pełnej, który ma zostać utrzymany na stałym poziomie (metoda clamp). W tym przypadku utrzymujemy euglikemię, czyli poziom 5,0–5,5 mM (Rysunek 2). Po każdym pobraniu próbki krwi należy przepłukać linię tętniczą niewielką objętością soli fizjologicznej z heparyną (10 U/ml), aby zapobiec krzepnięciu. UWAGA: Przed rozpoczęciem infuzji należy upewnić się, że w linii nie znajdują się skrzepy ani pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one spowodować u zwierzęcia udar.
- Rozpocząć wlew insuliny. Pomiar poziomu glukozy we krwi należy przeprowadzać w odstępach 5–10 minutowych, monitorując stężenie glukozy w każdym punkcie czasowym. Szybkość wlewu glukozy należy dostosować w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Proces ten zazwyczaj opiera się na metodzie prób i błędów i może trwać od 30 minut do >2h. Poziomy glukozy wymagane do utrzymania glikemii zależą od protokołu eksperymentalnego, gatunku oraz panujących warunków (Rysunek 2).
- Poziomy glukozy w stanie stacjonarnym definiuje się jako trzy kolejne pomiary mieszczące się w określonym zakresie. W tym przypadku za stan zaklemponowany uważa się trzy odczyty w granicach ~1 mM (np. 4,8; 5,2; 5,6 mM). Po osiągnięciu stanu stacjonarnego należy odnotować szybkość wlewu glukozy wymaganą do utrzymania glikemii przez okres 30 min. W tym czasie można pobrać dodatkowe próbki krwi. Należy pobrać co najmniej drugą próbkę insuliny w osoczu oraz próbkę do oznaczania hematokrytu.
- Po zakończeniu zaciskania zwierzęta mogą zostać poddane dalszym testom lub uśpione w celu pobrania tkanek do dalszych analiz. W zależności od zwierzęcia drogi cewnikowe mogą pozostawać drożne przez 5–7 dni.
D: Wyniki zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego (insulinowego)
Prawidłowo przeprowadzona procedura zacisku (clamp) pozwala ocenić wrażliwość szczura na insulinę w stanie stacjonarnym. Przy prezentacji danych uzyskanych z tej procedury niezbędne jest udokumentowanie poziomów glukozy oraz szybkości wlewu glukozy. Stabilne poziomy glukozy w czasie trwania minimum 30min (Rysunek 3) świadczą o osiągnięciu stanu stacjonarnego. Poziom glukozy uznaje się za stabilny tylko wtedy, gdy stężenie glukozy we krwi pełnej utrzymuje się w granicach ~1mM. Szybkość wlewu glukozy wskazuje poziom egzogennej glukozy niezbędny do utrzymania glikemii. Jeśli to możliwe, wartości te należy przedstawić w formie przebiegu czasowego, a nie jako pojedynczą wartość uśrednioną (Rysunek 4).
Inne zalecane parametry do raportowania to poziom insuliny w osoczu oraz hematokryt. Oznaczenie poziomu insuliny zarówno na czczo, jak i podczas zacisku insulinowego (insulin clamp) potwierdza prawidłowe podanie insuliny i pozwala wykryć wszelkie różnice w jej stężeniach pomiędzy grupami badawczymi (Rysunek 5). Sugeruje się pomiar hematokrytu w punkcie wyjściowym oraz po zakończeniu zacisku insulinowego (Rysunek 6). Ma to na celu zapewnienie, aby poziom hematokrytu nie spadł o więcej niż 5% w trakcie eksperymentu, a towarzyszące temu zmiany objętości i przepływu krwi nie wpłynęły na utylizację glukozy.
Rycina 1. Układ eksperymentalny. Rysunek 1 przedstawia świadższego szczura w stanie swobodnym podczas procedury zaciskania (clamp). Cewniki umożliwiają pobieranie próbek krwi i infuzje bez konieczności manipulowania zwierzęciem. Pompy po lewej stronie zawierają insulinę i glukozę.
Rysunek 2. Oczekiwane dane podczas procedury clampu. Aby uzyskać clamp na poziomach bazowych (euglikemia, 5 mM), manipuluje się poziomami egzogennej glukozy (D50) aż do osiągnięcia stanu bazowego lub tzw. clampu.
Rysunek 3. Oczekiwane wyniki poziomu glukozy w osoczu w procedurze clampu. Gdy zwierzę jest w stanie „zaklempowania” (clamped), poziom glukozy we krwi pozostaje stosunkowo stabilny w czasie i we wszystkich grupach eksperymentalnych.
Rysunek 4. Reprezentatywne szybkości wlewu glukozy podczas procedury clamp. Ilość egzogennej glukozy niezbędna do utrzymania euglikemii jest różna. Zilustrowano to na przykładzie zwierząt kontrolnych (karmionych standardową paszą) oraz zwierząt karmionych dietą wysokotłuszczową (z insulinoopornością). Zwierzę karmione dietą wysokotłuszczową wymaga mniejszej ilości wlewanej glukozy w celu utrzymania glikemii, przede wszystkim ze względu na insensytywność na wlewaną insulinę.
Rysunek 5. Reprezentatywny poziom insuliny w osoczu szczura. Poziom insuliny w osoczu podczas zacisku insulinowego powinien być wyższy niż poziom insuliny w osoczu w stanie czczym, w punkcie wyjściowym. Gwarantuje to prawidłowe podanie insuliny zwierzęciu podczas zacisku insulinowego.
Rysunek 6. Raportowanie hematokrytu. Należy wyznaczyć i zaraportować wartość hematokrytu wyjściowego oraz wartość po zakończeniu eksperymentu. Ma to na celu zapewnienie, aby poziom hematokrytu nie spadł o więcej niż 5% względem wartości wyjściowej w wyniku nadmiernego pobierania krwi tętniczej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Procedura clamp, opracowana początkowo do badania wrażliwości na insulinę u ludzi, została obecnie zaadaptowana do innych gatunków, w tym do szczurów i myszy laboratoryjnych. Badanie modeli zwierzęcych insulinooporności stanowi istotną pomoc w zrozumieniu patofizjologii wrażliwości na insulinę i związanych z nią patologii, a także w identyfikacji interwencji terapeutycznych o wartości klinicznej1,2. Do oceny wrażliwości na insulinę u zwierząt zastosowano kilka metod3. Techniki te obejmują warianty t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów. Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez Canadian Institutes of Health Research oraz Genome Canada. JS otrzymuje wsparcie finansowe w ramach stypendiów z Alberta Heritage Foundation for Medical Research, Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Canadian Diabetes Association. Szczególne podziękowania kierujemy do dr. Davida Wassermana i Bingle Bracy za przeszkolenie laboratorium Shearera w tej procedurze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przezroczysta rurka polietylenowa Intramedic (PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | Średnica wewnętrzna 0,58 mm (0,023") x średnica zewnętrzna 0,965 mm (0,038") |
| Laboratoryjna rurka Silastic Dow Corning | Fisher Scientific | 11-189-15C | Średnica wewnętrzna 0,76 mm (0,030") x średnica zewnętrzna 1,65 mm (0,065") |
| Medyczna rurka Tygon S-50-HL | Harvard Apparatus | PY2 72-1251 | Średnica wewnętrzna 3,2 mm (0,125") x średnica zewnętrzna 4,7 mm (0,1875") |
| Super Glue Loctite | Grand Toy | 32237 | W formie żelu (Gel Control) |
| Sterylny skalpel | VWR international | BD371610 | |
| Zakrzywiona mikropinceta preparacyjna | George Tiemann & Co. | 160-20 | x 2 |
| Prosta mikropinceta preparacyjna | George Tiemann & Co. | 160-15 | x 2 |
| Zakrzywiony zacisk hemostatyczny | George Tiemann & Co. | 105-1135 | x 2 |
| Prosty zacisk hemostatyczny | George Tiemann & Co. | 105-1130 | x 2 |
| Osłonki końcówek zacisków hemostatycznych | Robbins Instruments, Inc. | 15.09-2-004 | |
| Proste nożyczki chirurgiczne | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Adapter Luer do wielokrotnego pobierania próbek VENOJECT | Terumo Medical Corp. | 810127A | 21 G, 1 cal |
| Sterylny wprowadzacz do cewnika | BD Biosciences | 406999 | |
| Tępa igła 14 G | BD Biosciences | 511310 | 14 G, 2 cale |
| Sterylna nić chirurgiczna | Johnson & Johnson | 1679H | Jedwab, rozmiar 3-0 |
| Niesterylna nić chirurgiczna | Angiotech Pharmaceuticals, Inc. | SP116 | Jedwab, rozmiar 4-0 |
| Patyczki bawełniane | VWR international | 10806-005 | |
| 4-warstwowe gaziki | VWR international | CA43845-062 | |
| Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia małych zwierząt | Harvard Apparatus | 729063 | |
| Izofluran | Halocarbon Products Corp. | IPN-45 | |
| Wózek anestezjologiczny | Benson Medical Instruments | ||
| 70% etanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Antyseptyczny roztwór Betadine | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105267 | |
| Pompa strzykawkowa model 11 Plus | Harvard Apparatus | 702208 | |
| Stalowe łączniki do rurek | Harvard Apparatus | 72-4434 | 23 G, 0,3 cala |
| Stalowe zaślepki do rurek | Harvard Apparatus | 72-4436 | 23 G, 0,5 cala |
| Stalowe tępe igły | Instech Laboratories, Inc | LS22 | 22 G |
| Złącza Y 60 stopni | Small Parts, Inc. | STCY-22-05 | 22 G |
| Wirówka do mikrohematokrytu CritSpin | Iris Sample Processing | CS12 | |
| Miniwirówka | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Probówki do mikrowirówki | VWR international | 53550-778 | |
| Polipropylenowe probówki wirówkowe 50 ml | VWR international | 89004-364 | |
| Plastikowe strzykawki 1 ml z końcówką typu slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| Plastikowe strzykawki 3 ml z końcówką Luerlok | BD Biosciences | 309585 | |
| Wstrzykiwalna heparyna przeciwzakrzepowa | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 102824 | Producent: LEO Pharma Inc. Stężenie 1000 IU |
| Roztwór EDTA | Promega Corp. | V4231 | 0,5 M, pH 8,0 |
| Sól fizjologiczna | Western Drug Distribution Center, Ltd. | ABB7983154 | Producent: Hospira, 0,9% chlorku sodu |
| 50% dekstroza | Vétoquinol | 8DEX012D | |
| Humulin-R | Eli Lilly | HI-210 | 100 U/ml |
| Strzykawki insulinowe 1 ml | BD Biosciences | 309311 | |
| Uszczelniacz Fisherbrand* Hemato-Seal | Fisher Scientific | 02-678 | |
| Kapilary do mikrohematokrytu Fisherbrand* | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| Paski testowe One Touch Ultra | LifeScan, Inc. | AW 085-314H | |
| Glukometr One Touch Ultra | LifeScan, Inc. | AW 085-314B | |
| Pentobarbital sodu | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Stężenie 54,7 mg/ml |
| Czerwona taśma laboratoryjna do etykietowania | VWR international | 89097-932 | |
| Niebieska taśma laboratoryjna do etykietowania | VWR international | 89097-936 | |
| Waga | Fisher Scientific | 01-913-88 | |
| Mieszadło Vortex | VWR international | 58815-234 | |
| Timer | VWR international | 62344-641 |
Bibliografia
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat. Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding. Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).
- Cho, H. Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science. 292, 1728-1731 (2001).
- Dubois, M. J. The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis. Nat Med. 12, 549-556 (2006).
- Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).
- Herbach, N. Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice. Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).
- Maeda, N. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nat Med. 8, 731-737 (2002).
- Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance. Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P. Lost in translation. Diabetes. 58, 1947-1950 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
