$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A: Chirurgiczne cewnikowanie krążenia tętniczego i żylnego
Część 1: Przygotowanie cewników tętniczych i żylnych
- Odciąć 15 cm rurki PE-50 (średnica wewnętrzna 0,58 mm (0,023") x średnica zewnętrzna 0,965 mm (0,038")). Odciąć 1 mm fragment rurki silastycznej (średnica wewnętrzna 0,76 mm (0,030") x średnica zewnętrzna 1,65 mm (0,065")) do wykorzystania jako koralik stabilizujący. Koralik stabilizujący zapobiega wysunięciu cewnika przez szczura po jego umieszczeniu.
- Wprowadzić końcówki pęsety mikrochirurgicznej do światła koralika stabilizującego i delikatnie rozsunąć końcówki pęsety, aby rozszerzyć otwór. Używając drugiej pęsety mikrochirurgicznej, wsunąć rurkę silastyczną do światła koralika stabilizującego. Przymocować za pomocą mocnego kleju (Loctite Super Glue). Koralik musi ściśle przylegać do cewnika. Pozostawić cewnik do wyschnięcia (24 h).
- Dla szczura o masie 300 g linia tętnicza ma długość ~2,7 cm od koralika stabilizującego, natomiast linia żylna (z żyły szyjnej) ~3,2 cm. Długość cewników od koralika stabilizującego koryguje się o 0,5 cm na każde 100 g przyrostu masy ciała. Nie należy ściąć krawędzi cewnika pod kątem, ponieważ może to doprowadzić do przebicia naczynia podczas wprowadzania.
- Bezpośrednio przed operacją wypełnić linie solą fizjologiczną z heparyną (10 U/ml), uszczelnić oba końce stalowymi korkami do rurek i umieścić w etanolu (70%) w celu sterylizacji. Przed wprowadzeniem pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
Część 2: Przygotowanie chirurgiczne
- Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Canadian Association for Laboratory Animal Science dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów. Opisane poniżej procedury wykonano na dorosłych samcach szczurów Sprague-Dawley (~300g). Wszystkie czynności przeprowadzono w znieczuleniu izofluranem, choć możliwe jest zastosowanie środków znieczulających w formie wstrzyknięć. Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuje się z zachowaniem technik aseptycznych. Sprzęt chirurgiczny, zlewki oraz sól fizjologiczną z heparyną sterylizuje się w autoklawie. Rękawiczki chirurgiczne, strzykawki i aplikatory z bawełnianą końcówką są nabywane od dostawcy w formie wysterylizowanej.
- Zważyć szczura i zapisać wynik. Masa ciała będzie istotna podczas monitorowania zwierząt po operacji. Do eksperymentów należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta, które odzyskały masę ciała sprzed operacji. Znieczulić szczura (3% isoflurane) w komorze znieczulającej. Podczas operacji utrzymywać stężenie isofluranu na poziomie ~2% za pomocą maski nosowej. Zabieg musi być przeprowadzony w zdezynfekowanym obszarze zapewniającym asepsę.
- Przygotować zwierzę, usuwając sierść z miejsca operacji (szyja i łopatki). Można użyć małej maszynki do strzyżenia lub chemicznego depilatora. Procedurę tę należy przeprowadzić w miejscu oddzielonym od obszaru, w którym będzie odbywać się operacja.
- Unieruchomić zwierzę na stole operacyjnym. Upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, sprawdzając obecność odruchów łapy i oka. Przygotować pola operacyjne, stosując odpowiedni środek do dezynfekcji skóry (70% etanol, następnie betadyna, a na koniec ponownie 70% etanol).
Część 3: Operacja
- Wykonaj niewielkie pionowe nacięcie w linii środkowej, 1cm powyżej mostka (uchwyć skórę podłużnie wzdłuż osi przyśrodkowej pęsetą i przetnij nożyczkami lub skalpelem).
- Przeprowadź tępą dyssekcję za pomocą mikro-pęsety preparacyjnej, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Odsuń ten mięsień, aby odsłonić około 1cm lewej tętnicy szyjnej. Umieść mikro-pęsetę preparacyjną pod tętnicą szyjną, aby utrzymać ją w miejscu. Delikatnie oddziel tkankę łączną od tętnicy szyjnej. Ważne jest, aby odizolować nerw błędny od tętnicy, nie uszkadzając ani tętnicy, ani nerwu. Odizoluj tętnicę, a następnie podwiąż jej koniec głowowy nicią jedwabną 4-0 (posłuży ona do manipulowania tętnicą szyjną podczas operacji). Uwaga: nici 4-0 należy wysterylizować 70% etanolem przed użyciem.
- Zaciśnij naczynie ząbkowaną mikro-pęsetą preparacyjną. Przebij podwiązany koniec adapterem Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zatyczkę rurki i ostrożnie wprowadź cewnik za pomocą sterylnego wprowadnika, aby umieścić go w tętnicy. Trzymając cewnik pęsetą, częściowo zwolnij zacisk mikro-pęsety na tętnicy i kontynuuj wprowadzanie cewnika aż do koralika. W tym momencie końcówka cewnika powinna znajdować się w łuku aorty. Należy uważać, aby nie puścić cewnika, ponieważ ciśnienie w naczyniu wypchnie go na zewnątrz.
- Zwiąż bezpiecznie dwie nici 4-0 poniżej koralika i jedną powyżej, a następnie potwierdź możliwość poboru próbki z cewnika. Przepłucz linię solą fizjologiczną z heparyną 10U/ml. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zatyczką rurki.
- Korzystając z tego samego nacięcia, wykonaj tępą dyssekcję, aby odsłonić prawą zewnętrzną żyłę szyjną. Ostrożnie ją odizoluj i podwiąż koniec głowowy nicią jedwabną. Przebij żyłę adapterem Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zatyczkę rurki i wprowadź cewnik za pomocą sterylnego wprowadnika aż do koralika, a następnie zawiąż dwie nici poniżej koralika. Zawiąż trzecią nić powyżej koralika i potwierdź możliwość poboru próbki. Przepłucz linię żylną solą fizjologiczną z heparyną 10U/mL. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zatyczką rurki.
- Przeciągnij tępą igłę 14G pod skórą i wykonaj nacięcie na grzbiecie pomiędzy łopatkami. Przewlecz cewniki przez igłę, aby wyprowadzić je na zewnątrz na grzbiecie szczura. Widoczny powinien być odcinek linii o długości około 4cm. Odetnij 0.5cm rurki medycznej Tygon S-50-HL, załóż ją na oba wyprowadzone cewniki i zabezpiecz taśmą według potrzeb (niebieską dla żyły, czerwoną dla tętnicy). Ponownie sprawdź cewniki, aby upewnić się, że są drożne, przepłucz i napełnij solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml w celu zapobiegania krzepnięciu.
- Zamknij wszystkie nacięcia nicią jedwabną 3-0. Umieść szczura w pozycji brzusznej w podgrzanej, czystej klatce z pokarmem na dnie.
B: Opieka pooperacyjna
Część 1: Bezpośrednia opieka i monitorowanie pooperacyjne
- Gdy szczur odzyska pełną zdolność poruszania się i czujność, należy przenieść go z powrotem do klatki.
- Pozostawić szczura w rekonwalescencji przez 3-5 dni.
- Codziennie monitorować występowanie infekcji, bólu oraz zmiany masy ciała. Podejrzenie infekcji pojawia się w przypadku zaobserwowania wysięku z miejsc nacięć, ogólnej letargii i/lub bólu. Ból objawia się zgarbioną postawą, zjeżoną sierścią na grzbiecie oraz brakiem aktywności ruchowej i/lub apetytu. Spadek masy ciała może wystąpić bezpośrednio po operacji i utrzymywać się do trzech dni po zabiegu, jednakże w ciągu 5 dni waga powinna się ustabilizować i/lub wzrosnąć do poziomu w obrębie 10% masy przedoperacyjnej. Silny spadek masy ciała może wskazywać na infekcję, udar i/lub ból.
- Codziennie sprawdzać drożność cewników.
Część 2: Utrzymywanie drożności cewnika
- Każdego dnia podczas rekonwalescencji pooperacyjnej należy napełnić strzykawki 1ml ze stożkiem (Slip Tip) solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 150U/ml i zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22 G. Tępa igła jest włożona w 20cm rurki PE-50 z łącznikiem ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23 G na drugim końcu.
- Należy usunąć pęcherzyki powietrza, umieszczając koniec z łącznikiem rurki powyżej reszty strzykawki 1ml i wypychając pęcherzyki z przewodu.
- Zewnętrzną linię tętniczą szczura należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej korka.
- Za pomocą drugiej pary kleszczyków hemostatycznych należy usunąć stalowy korek cewnika.
- Należy włożyć łącznik rurki podłączony do strzykawki do linii tętnicznej, a następnie zwolnić kleszczyki blokujące zewnętrzny cewnik tętniczy.
- Należy aspirować krew tętniczą z cewnika do strzykawki. Jeśli cewnik nie zasysa krwi łatwo, może być konieczne bardzo delikatne wstrzyknięcie niewielkiej ilości roztworu płuczącego przez cewnik, aby odblokować jego końcówkę w przypadku, gdyby była ona przyciśnięta do ściany naczynia. Cewnik jest całkowicie drożny, gdy krew dotrze do strzykawki.
- Należy zacisnąć rurkę PE-50 blisko strzykawki 1ml i zutylizować strzykawkę. Należy ją zastąpić nową strzykawką napełnioną świeżą solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml. Po zwolnieniu zacisku rurki i trzymając nową strzykawkę pionowo, należy stuknąć w nią palcem, aby przesunąć ewentualne nowe pęcherzyki powietrza do góry i z dala od linii. Uwaga: Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować udar.
- Należy wstrzyknąć sól fizjologiczną z heparyną 150U/ml, aż linia cewnika będzie przejrzysta i wolna od krwi.
- Zewnętrzną linię tętniczą szczura należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej łącznika rurki. Następnie należy odłączyć złącze strzykawki z linii cewnika tętniczego i zastąpić je stalowym korkiem do rurek.
- Należy zwolnić kleszczyki blokujące zewnętrzny cewnik tętniczy.
- Procedurę należy powtórzyć dla linii żylnej. Jednak ze względu na niskie ciśnienie żylne pobieranie próbek często nie jest możliwe. Jeśli sól fizjologiczna z heparyną 150U/ml może być infundowana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest dobrze umieszczony w żyle.
C: Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny
Część 1: Konfiguracja i przygotowanie zacisków
- Zważ szczura i zapisz jego masę. Będzie ona niezbędna do określenia szybkości wlewów insuliny i glukozy. Pozostaw szczura na czczo przez co najmniej 5h przed eksperymentem. Zapewni to, że zwierzę znajduje się w stanie poposiłkowym, a wkład glukozy z pożywienia zostanie zminimalizowany. Umieść szczura w małym pojemniku/klatce z ściółką, która ogranicza nadmierny ruch. Zwierzę powinno mieć możliwość swobodnego obracania się i pielęgnacji.
- Przygotuj linie i pompy infuzyjne zgodnie z Rysunkiem 1. Długości przewodów połączeniowych P50 są następujące: od strzykawki do złącza Y wynosi 8cm, od złącza Y do szczura 15cm, linia tętnicza 20cm, a linia żylna 10cm. Usuń stalowe zatyczki przewodów i przepłucz linie żylną oraz tętniczą roztworem soli fizjologicznej z heparyną (10U/ml), aby zapewnić odpowiednio drożność wlewu i pobierania próbek.
- Określ wymaganą objętość insuliny. Będzie ona zależała od poziomu insuliny i masy szczura. W tym przypadku dawkę 4mU/kg/min podaje się z prędkością 2uL/min. Jest to wysoka dawka fizjologiczna. W miarę możliwości należy dążyć do ograniczenia objętości wlewów. Insulina powinna być odpowiednio rozcieńczona i podawana w obecności osocza. W tym laboratorium do rozcieńczania insuliny stosuje się 3% roztwór osocza szczura w soli fizjologicznej. Stosowana insulina to HumulinR 100U/ml (Eli Lily), choć można użyć innych insulin szybkodziałających. Przed pobraniem rozcieńczonej insuliny do strzykawki infuzyjnej należy upewnić się, że jest ona dobrze wymieszana.
- Przygotuj 50% roztwór dekstrozy. Można go wprowadzić bezpośrednio do strzykawki w pompie infuzyjnej. Oznacz pompę napisem „glukoza”, aby uniknąć pomyłek w przyszłości. Pamiętaj o zapewnieniu wystarczających objętości insuliny i glukozy na potrzeby badania. Kleszcze zazwyczaj wytrzymują ok. 2h. W niniejszym protokole stosowane są strzykawki 3ml.
- Umieść strzykawki z glukozą i insuliną w pompach strzykawkowych Harvard Apparatus Model 11 Plus. Przesuń glukozę do złącza Y i zaklemuj linię kleszczykami hemostatycznymi. Przesuń insulinę do zwierzęcia i zaklemuj linię kleszczykami. Zaklemuj linie i pozwól szczurowi odpocząć przez 30min przed rozpoczęciem eksperymentu. UWAGA: Zaleca się stosowanie osłonek końcówek kleszczyków, aby uniknąć trwałego zagięcia przewodów.
- Przygotuj wirówkę oraz probówki powlekane EDTA do pobierania osocza. W niniejszym badaniu dodatkowe próbki krwi zostaną pobrane po zaklemowaniu zwierzęcia.
Część 2: Protokół eksperymentalny
- Należy pobrać wyjściową próbkę insuliny oraz próbkę do oznaczenia hematokrytu. Pobieranie hematokrytu pozwala upewnić się, że objętość krwi jest utrzymana przez cały czas trwania eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej.
- Należy pobrać wyjściową próbkę glukozy (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) i określić poziom glukozy we krwi pełnej, który będzie utrzymywany (clamp). W tym przypadku utrzymujemy euglikemię, czyli poziom 5.0-5.5mM (Rysunek 2). Po każdym pobraniu krwi linię tętniczą należy przepłukać niewielką objętością soli fizjologicznej z heparyną (10U/ml), aby zapobiec krzepnięciu. UWAGA: Przed infuzją należy upewnić się, że w linii nie ma skrzepów ani pęcherzyków powietrza. Mogą one spowodować u zwierzęcia udar.
- Rozpocząć infuzję insuliny. Poziom glukozy we krwi należy mierzyć w odstępach 5-10min, monitorując go w każdym punkcie czasowym. Szybkość infuzji glukozy należy dostosować w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Proces ten polega zazwyczaj na metodzie prób i błędów i może trwać od 30min do >2h. Poziomy glukozy wymagane do utrzymania glikemii zależą od protokołu eksperymentalnego, gatunku i panujących warunków (Rysunek 2).
- Poziomy glukozy w stanie stacjonarnym to trzy kolejne odczyty mieszczące się w określonym zakresie. W tym przypadku za poziom utrzymany (clamped) uznaje się trzy odczyty w zakresie ~1mM (np. 4.8, 5.2, 5.6mM). Po osiągnięciu stanu stacjonarnego należy zapisać szybkość infuzji glukozy wymaganą do utrzymania glikemii przez okres 30min. W tym czasie można pobrać dodatkowe próbki krwi. Należy pobrać co najmniej drugą próbkę insuliny w osoczu oraz próbkę do oznaczenia hematokrytu.
- Po zakończeniu procedury clamp zwierzęta mogą zostać wykorzystane do dalszych testów lub poddane eutanazji, a ich tkanki pobrane do dalszych analiz. W zależności od zwierzęcia, linie cewników mogą pozostać drożne przez 5-7 dni.
D: Wyniki zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego (insulinowego)
Prawidłowo przeprowadzona procedura clamp pozwala ocenić insulinowrażliwość szczura w stanie stacjonarnym. Podczas prezentacji danych uzyskanych z metody clamp niezbędne jest udokumentowanie poziomu glukozy oraz szybkości wlewu glukozy. Stabilny poziom glukozy w czasie trwania co najmniej 30min (Rycina 3) wskazuje na osiągnięcie stanu stacjonarnego. Poziom glukozy uznaje się za stabilny tylko wtedy, gdy stężenie glukozy we krwi pełnej utrzymuje się w granicach ~1mM. Szybkość wlewu glukozy wskazuje ilość egzogennej glukozy niezbędnej do utrzymania glikemii. Jeśli to możliwe, wartości te powinny być przedstawione jako przebieg w czasie, a nie jako pojedyncza wartość uśredniona (Rycina 4).
Innymi zalecanymi parametrami do raportowania są stężenie insuliny w osoczu oraz hematokryt. Oznaczenie poziomu insuliny zarówno na czczo, jak i podczas zacisku insuliny (insulin clamp) potwierdza, że insulina została skutecznie podana, a także pozwala wykryć wszelkie różnice w poziomach między grupami badawczymi (Rycina 5). Sugeruje się pomiar hematokrytu w punkcie wyjściowym oraz po zakończeniu zacisku insuliny (Rycina 6). Ma to na celu upewnienie się, że poziom hematokrytu nie spadnie o więcej niż 5% podczas eksperymentu, a towarzyszące temu zmiany objętości i przepływu krwi nie wpłyną na utylizację glukozy.
Rysunek 1. Układ eksperymentalny. Rysunek 1 przedstawia niekrępowanego, świadomego szczura podczas procedury clamp. Cewniki umożliwiają pobieranie krwi i infuzje bez konieczności manipulowania zwierzęciem. Pompy po lewej stronie zawierają insulinę i glukozę.
Rycina 2. Oczekiwane dane podczas procedury clamp. Aby uzyskać clamp na poziomach bazowych (euglikemia, 5mM), poziomy egzogennej glukozy (D50) są manipulowane do momentu osiągnięcia poziomu bazowego lub stanu „clamp”.
Rysunek 3. Oczekiwane wyniki poziomu glukozy w osoczu podczas procedury clamp. Gdy zwierzę jest w stanie „clamp”, poziom glukozy we krwi pozostaje stosunkowo stabilny w czasie i we wszystkich grupach eksperymentalnych.
Rysunek 4. Reprezentatywne szybkości wlewu glukozy podczas procedury clamp. Ilość egzogennej glukozy wymagana do utrzymania euglikemii jest zróżnicowana. Zilustrowano to na przykładzie zwierząt z grupy kontrolnej (żywione standardową karmą) oraz zwierząt żywionych dietą wysokotłuszczową (opornych na insulinę). Zwierzę żywione dietą wysokotłuszczową wymaga mniejszego wlewu glukozy w celu utrzymania glikemii, przede wszystkim ze względu na insensytywność na podawaną insulinę.
Rycina 5. Reprezentatywne stężenie insuliny w osoczu szczura. Stężenie insuliny w osoczu podczas zacisku insulinowego (insulin clamp) powinno być wyższe niż bazowe stężenie insuliny w osoczu na czczo. Potwierdza to, że insulina została prawidłowo podana zwierzęciu podczas procedury zacisku insulinowego.
Rysunek 6. Raportowanie poziomu hematokrytu. Należy oznaczyć i zaraportować wyjściowy poziom hematokrytu oraz poziom hematokrytu po zakończeniu eksperymentu. Pozwala to upewnić się, że poziom hematokrytu nie spadł o więcej niż 5% w stosunku do wartości wyjściowej w wyniku nadmiernego pobierania krwi tętniczej.