$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
A: Chirurgiczne cewnikowanie krążenia tętniczego i żylnego
Część 1: Przygotowanie cewników tętniczych i żylnych
- Odciąć 15 cm rurki PE-50 (średnica wewnętrzna 0,58 mm (0,023") x średnica zewnętrzna 0,965 mm (0,038")). Odciąć 1 mm odcinek rurki silastycznej (średnica wewnętrzna 0,76 mm (0,030") x średnica zewnętrzna 1,65 mm (0,065")), aby służył jako koralik ograniczający. Koralik ograniczający zapobiega wysunięciu cewnika przez szczura po jego umieszczeniu na miejscu.
- Wprowadzić końcówki pęsety mikrosekcyjnej do światła koralika ograniczającego i delikatnie rozsunąć końcówki pęsety, aby rozszerzyć otwór. Używając drugiej pęsety mikrosekcyjnej, wsunąć rurkę silastyczną do światła koralika ograniczającego. Przymocować za pomocą mocnego kleju (Loctite Super Glue). Koralik musi przylegać płasko do cewnika. Pozostawić cewnik do wyschnięcia (24 h).
- Dla szczura o masie 300 g linia tętnicza ma długość ~2,7 cm od koralika ograniczającego, natomiast linia żylna z żyły szyjnej ma ~3,2 cm. Długość cewników od koralika reguluje się o 0,5 cm na każde 100 g przyrostu masy ciała. Nie należy ściąć krawędzi cewnika pod kątem, ponieważ może to spowodować przebicie naczynia podczas wprowadzania.
- Bezpośrednio przed operacją wypełnić linie solą fizjologiczną z heparyną (10 U/ml), uszczelnić oba końce stalowym korkiem do rurek i umieścić w etanolu (70%) w celu sterylizacji. Przed wprowadzeniem pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
Część 2: Przygotowanie chirurgiczne
- Procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Calgary i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych dotyczącymi przeprowadzania eksperymentów. Poniżej opisane procedury wykonano na dorosłych samcach szczurów rasy Sprague-Dawley (~300g). Wszystkie procedury przeprowadzano w znieczuleniu izofluranem, choć możliwe jest zastosowanie środków znieczulających w formie wstrzyknięć. Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuje się z zachowaniem technik aseptycznych. Sprzęt chirurgiczny, zlewki oraz sól fizjologiczną z heparyną sterylizuje się w autoklawie. Rękawiczki chirurgiczne, strzykawki i aplikatory z bawełnianą końcówką są nabywane od dostawcy w formie sterylnej.
- Zważyć szczura i zapisać wynik. Masa ciała będzie istotna podczas pooperacyjnego monitorowania zwierząt. Do eksperymentów należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta, które odzyskały masę ciała sprzed operacji. Znieczulić szczura (3% isoflurane) w komorze znieczulającej. Podczas operacji utrzymywać stężenie ~2% isoflurane za pomocą maski nosowej. Zabieg chirurgiczny musi być przeprowadzony w zdezynfekowanym obszarze zapewniającym asepsję.
- Przygotować zwierzę poprzez usunięcie sierści z miejsca operowanego (szyja i łopatki). Można użyć małej maszynki do strzyżenia lub chemicznego depilatora. Procedurę tę należy przeprowadzić w miejscu oddzielonym od obszaru, w którym będzie wykonywana operacja.
- Umożliwić unieruchomienie zwierzęcia na stole operacyjnym. Upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, sprawdzając obecność odruchów stopy/oka. Przygotować pole operacyjne za pomocą odpowiedniego środka do dezynfekcji skóry (70% etanol, następnie betadyna, a na koniec ponownie 70% etanol).
Część 3: Zabieg chirurgiczny
- Wykonaj niewielkie pionowe nacięcie w linii środkowej 1 cm powyżej mostka (uchwyć skórę wzdłuż osi przyśrodkowej pęsetą i przetnij nożyczkami lub skalpelem).
- Przeprowadź tępą dyssekcję za pomocą mikropęsety, aby odsłonić lewy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy. Odsunnij ten mięsień, aby odsłonić około 1 cm lewej tętnicy szyjnej. Umieść mikropęsetę pod tętnicą szyjną, aby ją ustabilizować. Delikatnie oddziel tkankę łączną od tętnicy szyjnej. Ważne jest, aby odizolować nerw błędny od tętnicy, nie uszkadzając ani tętnicy, ani nerwu. Po wyizolowaniu tętnicy podwiąż jej koniec głowowy nicią jedwabną 4-0 (posłuży ona do manipulowania tętnicą szyjną podczas operacji). Uwaga: nici 4-0 należy wysterylizować w 70% etanolu przed użyciem.
- Zaciśnij naczynie ząbkowaną mikropęsetą. Przebij podwiązany koniec za pomocą adaptera Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zatyczkę rurki i ostrożnie wprowadź cewnik przy pomocy sterylnego prowadnika do cewnika do wnętrza tętnicy. Przytrzymując cewnik pęsetą, częściowo zwolnij uścisk mikropęsety na tętnicy i kontynuuj wprowadzanie cewnika aż do koralika. Na tym etapie końcówka cewnika powinna znajdować się w łuku aorty. Należy uważać, aby nie puścić cewnika, ponieważ ciśnienie w naczyniu może go wypchnąć.
- Zwiąż bezpiecznie dwie nici 4-0 poniżej koralika i jedną powyżej, a następnie potwierdź możliwość poboru próbek przez cewnik. Przepłucz linię solą fizjologiczną z heparyną 10U/ml. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zatyczką rurki.
- Korzystając z tego samego nacięcia, przeprowadź tępą dyssekcję, aby odsłonić prawą żyłę szyjną zewnętrzną. Ostrożnie wyizoluj i podwiąż jej koniec głowowy nicią jedwabną. Przebij żyłę za pomocą adaptera Luer VENOJECT Multi-Sample o rozmiarze 21G. Usuń stalową zatyczkę rurki i wprowadź cewnik przy pomocy sterylnego prowadnika aż do koralika, a następnie zwiąż dwie nici poniżej koralika. Zwiąż trzecią nić powyżej koralika i potwierdź możliwość poboru próbek. Przepłucz linię żylną solą fizjologiczną z heparyną 10U/mL. Ponownie zamknij zewnętrzny koniec cewnika stalową zatyczką rurki.
- Przeprowadź tępą igłę 14G pod skórą i wykonaj nacięcie na grzbiecie między łopatkami. Przeciągnij cewniki przez igłę, aby wyprowadzić je na zewnątrz na grzbiecie szczura. Widoczny powinien być odcinek linii o długości około 4 cm. Odetnij fragment rurki medycznej Tygon S-50-HL o długości 0,5 cm, nałóż go na oba wyprowadzone cewniki i zabezpiecz taśmą w razie potrzeby (niebieską dla żyły, czerwoną dla tętnicy). Ponownie sprawdź drożność cewników, przepłucz je i wypełnij solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml, aby zapobiec zakrzepom.
- Zamknij wszystkie nacięcia nicią jedwabną 3-0. Umieść szczura w pozycji brzusznej w uprzednio ogrzanej, czystej klatce z pokarmem na dnie.
B: Opieka pooperacyjna
Część 1: Bezpośrednia opieka i monitorowanie pooperacyjne
- Gdy szczur odzyska pełną zdolność poruszania się i czujność, należy przenieść go z powrotem do klatki.
- Pozostawić szczura w rekonwalescencji przez 3-5 dni.
- Codziennie monitorować pod kątem infekcji, bólu oraz zmian masy ciała. Podejrzenie infekcji pojawia się w przypadku zaobserwowania wycieku z miejsc nacięć, ogólnej letargii i/lub bólu. Ból objawia się skuloną postawą, zmierzwionym futrem na grzbiecie oraz brakiem aktywności ruchowej i/lub łaknienia. Spadek masy ciała może wystąpić bezpośrednio po operacji do trzech dni po zabiegu, jednakże w ciągu 5 dni masa ciała powinna się ustabilizować i/lub wzrosnąć do poziomu w granicach 10% masy przedsurgicalnej. Silny spadek masy ciała może wskazywać na infekcję, udar i/lub ból.
- Codziennie sprawdzać drożność cewników.
Część 2: Utrzymywanie drożności cewnika
- Każdego dnia podczas rekonwalescencji pooperacyjnej należy napełnić strzykawki 1ml typu Slip Tip solą fizjologiczną z heparyną w stężeniu 150U/ml i zamknąć je tępą igłą o rozmiarze 22G. Tępa igła jest włożona w 20cm rurki PE-50 z łącznikiem ze stali nierdzewnej o rozmiarze 23G na drugim końcu.
- Pęcherzyki powietrza należy usunąć, ustawiając koniec z łącznikiem rurki powyżej pozostałej części strzykawki 1ml i wypychając pęcherzyki z przewodu.
- Wyprowadzoną z organizmu szczura linię tętniczą należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej korka.
- Za pomocą drugiej pary kleszczyków hemostatycznych należy usunąć stalowy korek cewnika.
- Należy wprowadzić łącznik rurki podłączony do strzykawki do linii tętniczej i zwolnić kleszczyki blokujące wyprowadzoną cewnik tętniczy.
- Krew tętniczą z cewnika należy odessać do strzykawki. Jeśli krew nie jest zasysana łatwo, może być konieczne bardzo delikatne wstrzyknięcie niewielkiej ilości roztworu płuczącego przez cewnik, aby odblokować jego końcówkę, w przypadku gdy zaparła się ona o ścianę naczynia. Cewnik jest całkowicie drożny, gdy krew dotrze do strzykawki.
- Należy zacisnąć rurkę PE-50 blisko strzykawki 1ml i zutylizować strzykawkę. Należy ją zastąpić nową strzykawką napełnioną świeżą solą fizjologiczną z heparyną 150U/ml. Po zwolnieniu zacisku rurki i trzymając nową strzykawkę pionowo, należy stuknąć w nią palcem, aby przesunąć ewentualne nowe pęcherzyki powietrza w górę i z dala od przewodu. Uwaga: Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ pęcherzyki powietrza mogą spowodować udar.
- Należy wstrzyknąć sól fizjologiczną z heparyną 150U/ml, aż linia cewnika będzie czysta i wolna od krwi.
- Wyprowadzoną z organizmu szczura linię tętniczą należy zacisnąć kleszczykami hemostatycznymi tuż poniżej łącznika rurki. Należy odłączyć złącze strzykawki od linii cewnika tętniczego i zastąpić je stalowym korkiem do rurek.
- Należy zwolnić kleszczyki blokujące wyprowadzoną cewnik tętniczy.
- Procedurę należy powtórzyć dla linii żylnej. Jednak ze względu na niskie ciśnienie żylne pobieranie próbek jest często niemożliwe. Jeśli sól fizjologiczna z heparyną 150U/ml może być infuzowana przy minimalnym oporze, prawdopodobnie cewnik jest dobrze umiejscowiony w żyle.
C: Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny
Część 1: Konfiguracja i przygotowanie zacisków
- Zważ szczura i zapisz jego masę. Będzie ona niezbędna do określenia szybkości infuzji insuliny i glukozy. Poddaj szczura postowi przez co najmniej 5h przed eksperymentem. Zapewni to stan poposiłkowy u zwierzęcia i zminimalizuje wkład glukozy z produktów spożywczych. Umieść szczura w małym pojemniku/klatce z podścielką ograniczającą nadmierny ruch. Zwierzę powinno mieć możliwość swobodnego obracania się i pielęgnacji.
- Przygotuj linie i pompy infuzyjne zgodnie z Rysunkiem 1. Długości przewodów połączeniowych P50 są następujące: od strzykawki do łącznika Y wynosi 8cm, od łącznika Y do szczura 15cm, linia tętnicza 20cm, a linia żylna 10cm. Usuń stalowe zatyczki z przewodów i przemyj linie szyjne oraz tętnicze 10U/ml soli fizjologicznej z heparyną, aby zapewnić odpowiednio infuzję i pobieranie próbek.
- Wyznacz wymaganą objętość insuliny. Będzie ona zależeć od poziomu insuliny i masy szczura. W tym przypadku 4mU/kg/min podaje się z prędkością 2uL/min. Jest to wysoka dawka fizjologiczna. W miarę możliwości należy dążyć do ograniczenia objętości infuzji. Insulinę należy odpowiednio rozcieńczyć i podawać w obecności osocza. W tym laboratorium do rozcieńczania insuliny stosuje się 3% roztwór osocza szczura w soli fizjologicznej. Stosowana insulina to HumulinR 100U/ml (Eli Lily), choć można użyć innych insulin szybkodziałających. Przed umieszczeniem w strzykawce infuzyjnej upewnij się, że rozcieńczona insulina została dobrze wymieszana.
- Przygotuj 50% roztwór dekstrozy. Można go wprowadzić bezpośrednio do strzykawki w pompie infuzyjnej. Oznacz pompę napisem „glukoza”, aby uniknąć pomyłek w przyszłości. Pamiętaj o zapewnieniu wystarczających objętości insuliny i glukozy na potrzeby badania. Klemowanie zazwyczaj trwa ~2h. W niniejszym protokole stosowane są strzykawki 3ml.
- Umieść strzykawki z glukozą i insuliną w pompach strzykawkowych Harvard Apparatus Model 11 Plus. Przesuń glukozę do łącznika Y i zaklemuj linię kleszczykami hemostatycznymi. Przesuń insulinę do zwierzęcia i zaklemuj linię kleszczykami hemostatycznymi. Zaklemuj linie i pozwól szczurowi odpocząć przez 30min przed rozpoczęciem eksperymentu. UWAGA: Zaleca się stosowanie osłon końcówek kleszczyków, aby uniknąć trwałego zgniecenia przewodów.
- Przygotuj wirówkę i probówki powlekane EDTA do pobierania osocza. W niniejszym badaniu dodatkowe próbki krwi zostaną pobrane po zaklemowaniu zwierzęcia.
Część 2: Protokół eksperymentalny
- Należy pobrać wyjściową próbkę insuliny oraz próbkę do oznaczania hematokrytu. Pobieranie hematokrytu pozwala upewnić się, że objętość krwi jest utrzymywana na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu. Zazwyczaj poziom hematokrytu nie powinien spaść o więcej niż 10% wartości początkowej.
- Należy pobrać wyjściową próbkę glukozy (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) i wyznaczyć poziom glukozy we krwi pełnej, który będzie utrzymywany (clamp). W tym przypadku utrzymujemy poziom euglikemii, czyli 5,0-5,5mM (Rycina 2). Po każdym pobraniu krwi należy przepłukać linię tętniczą niewielką objętością soli fizjologicznej z heparyną 10U/ml, aby zapobiec krzepnięciu. UWAGA: Przed infuzją należy upewnić się, że w linii nie ma skrzepów ani pęcherzyków powietrza. Mogą one doprowadzić do udaru u zwierzęcia.
- Należy rozpocząć infuzję insuliny. Poziom glukozy we krwi należy mierzyć w odstępach 5-10min, monitorując go w każdym punkcie czasowym. Szybkość infuzji glukozy należy dostosowywać w razie potrzeby, aż do osiągnięcia stanu stacjonarnego. Proces ten zazwyczaj opiera się na metodzie prób i błędów i może trwać od 30min do >2h. Poziomy glukozy wymagane do utrzymania glikemii zależą od protokołu eksperymentalnego, gatunku oraz panujących warunków (Rycina 2).
- Stany stacjonarne poziomu glukozy to trzy kolejne odczyty mieszczące się w określonym zakresie. W tym przypadku za poziom utrzymany (clamped) uznaje się trzy odczyty w zakresie ~1mM (np. 4,8, 5,2, 5,6mM). Po osiągnięciu stanu stacjonarnego należy zapisać szybkość infuzji glukozy niezbędną do utrzymania glikemii przez okres 30min. W tym czasie można pobrać dodatkowe próbki krwi. W minimum należy pobrać drugą próbkę insuliny w osoczu oraz próbkę do oznaczania hematokrytu.
- Po zakończeniu procedury clamp zwierzęta mogą zostać wykorzystane do dalszych testów lub uśmiercone, a tkanki pobrane do dalszych analiz. W zależności od zwierzęcia, linie cewnikowe mogą pozostawać drożne przez 5-7 dni.
D: Wyniki zacisku hiperinsulinemiczno-euglikemicznego (insulinowego)
Prawidłowo przeprowadzona procedura clamp pozwala na ocenę wrażliwości szczura na insulinę w stanie stacjonarnym. Przy prezentowaniu danych uzyskanych z metody clamp niezbędne jest udokumentowanie poziomów glukozy oraz szybkości wlewu glukozy. Stabilne poziomy glukozy w czasie trwania co najmniej 30min (Rysunek 3) świadczą o osiągnięciu stanu stacjonarnego. Glukozę uznaje się za stabilną tylko wtedy, gdy poziom glukozy we krwi pełnej utrzymuje się w granicach ~1mM. Szybkości wlewu glukozy wskazują poziomy egzogennej glukozy wymagane do utrzymania glikemii. W miarę możliwości wartości te powinny być przedstawione jako przebieg czasowy, a nie jako pojedyncza wartość uśredniona (Rysunek 4).
Innymi zalecanymi parametrami do raportowania są poziom insuliny w osoczu oraz hematokryt. Oznaczenie poziomu insuliny na czczo oraz podczas zacisku insuliny (insulin clamp) potwierdza, że insulina została skutecznie podana, i pozwala wykryć wszelkie różnice w poziomach między grupami badawczymi (Rysunek 5). Sugeruje się pomiar hematokrytu w punkcie wyjściowym oraz po zakończeniu zacisku insuliny (Rysunek 6). Ma to na celu zapewnienie, aby poziom hematokrytu nie spadł o więcej niż 5% podczas eksperymentu, a towarzyszące temu zmiany objętości i przepływu krwi nie wpływały na utylizację glukozy.
Rycina 1. Układ eksperymentalny. Rycina 1 przedstawia nieskrępowanego, świadomego szczura podczas procedury clamp. Cewniki umożliwiają pobieranie krwi i infuzje bez konieczności manipulowania zwierzęciem. Pompy po lewej stronie zawierają insulinę i glukozę.
Rycina 2. Oczekiwane dane podczas procedury zacisku. Aby uzyskać zacisk na poziomach bazowych (euglikemia, 5mM), manipuluje się poziomami egzogennej glukozy (D50), aż do osiągnięcia poziomu bazowego lub „zacisku”.
Rysunek 3. Oczekiwane wyniki poziomu glukozy w osoczu podczas procedury zacisku (clamp). Gdy zwierzę jest w stanie „zacisku”, poziom glukozy we krwi pozostaje względnie stabilny w czasie oraz pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
Rycina 4. Reprezentatywne szybkości wlewu glukozy podczas procedury zacisku (clamp). Ilość egzogennej glukozy wymagana do utrzymania euglikemii jest różna. Zilustrowano to na przykładzie zwierząt z grupy kontrolnej (karmionych paszą standardową) oraz zwierząt karmionych dietą wysokotłuszczową (z insulinoopornością). Zwierzę karmione dietą wysokotłuszczową wymaga mniejszego wlewu glukozy w celu utrzymania glikemii, przede wszystkim ze względu na insensytywność na podawaną insulinę.
Rysunek 5. Reprezentatywny poziom insuliny w osoczu szczura. Poziom insuliny w osoczu podczas zacisku insulinowego powinien być wyższy niż bazowy poziom insuliny w osoczu na czczo. Potwierdza to, że insulina została prawidłowo podana zwierzęciu podczas zacisku insulinowego.
Rysunek 6. Raportowanie hematokrytu. Należy wyznaczyć i zaraportować bazowy poziom hematokrytu oraz poziom hematokrytu po zakończeniu eksperymentu. Pozwala to upewnić się, że poziomy hematokrytu nie spadły o więcej niż 5% wartości bazowej w wyniku nadmiernego pobierania krwi tętniczej.