Ten film pokazuje protokół izolowania interesujących bakterii jelitowych od dzikich robaków Caenorhabditis . Robaki są najpierw głodzone i myte, aby wyeliminować pozostałości bakterii żerujących z ich powierzchni i światła jelit, jednocześnie zachowując docelowe mikroorganizmy. Po oczyszczeniu powierzchni i kilku etapach pełzania robaki są rozcinane w celu wyodrębnienia jelit zawierających interesujące bakterie, które następnie są zbierane i zamrażane do przechowywania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Selektywne oczyszczanie robaków wywołanych chorobą piersiową w celu wzbogacenia mikrobioty jelitowej
330 wyświetleń
⸱
2 lutego 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Sekcja jelit i identyfikacja PCR gatunków drobnoustrojów
1. Hodować zwierzęta w temperaturze 20 °C przez 3-4 dni, aby mogły głodzić i zmniejszyć ilość bakterii OP50-1 (szczep Escherichia coli OP50-1). Dodaj 5 mL medium M9 do płytki z głodnymi robakami.
2. Używając sterylnej szklanej pipety i żarówki, podłącz z płyty robaki M9+ i przenieś je do sterylnej rurki wirówki 15 mL.
3. Za pomocą wirówki klinicznej obróć robaki w rurce w temperaturze 1000 x g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
4. Używając sterylnej pipety 15 mL, usuń supernatant z rurki wirówki, nie naruszając żywych robaków na dnie rurki.
5. Dodaj 10 ml M9 + 0,05% Triton X-100 i inkubuj rurkę na nutatorze przez 20 minut, aby usunąć zewnętrzne drobnoustroje. Powtórz cztery razy, aby umyć robaki.
6. Po ostatnim myciu, używając sterylnej końcówki pipety, usuń supernatant bez naruszania granulki na dnie w 100 μL roztworu.
7. Używając sterylnej końcówki pipety, przenieś M9 i robaki na nienasioną płytkę NGM i pozwól jej wyschnąć, podczas gdy robaki przez 20 minut pełzają, aby pomóc usunąć OP50-1 z skórki i jelita.
8. Dodaj 250 μL M9 do wysuszonej płyty i użyj szklanej pipety, aby przenieść M9+ robaki na nową, nienasioną płytę NGM. Jeszcze raz pozwól tej płytce wyschnąć i pozwól robakom pełzać przez 20 minut.
9. Dodaj 250 μL M9 do płyty i przelej 100 μL M9+ robaków do czystej szklanki.
10. Używając dwóch sterylnych igieł do strzykawek 26 G, odciąć nicienie przez przytrzymanie robaka jedną igłą, a drugą igłą przecięcie robaka. Po dekapitacji jelito (ziarniste) i gonada (przezroczysta) z ciała naturalnie wychodzą z organizmu.
11. Odetnij kawałek odsłoniętego jelita, przytrzymując jelito jedną igłą i przecinając drugą.
UWAGA: Jeśli to możliwe, potwierdzenie, że interesujący mikroorganizm nadal występuje w wyciśnienych jelitach za pomocą mikroskopii normarskiej, fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) lub immunohistochemii.
12. Przenieść pojedynczą rozciętą jelitę do rurki PCR o pojemności 0,5 mL zawierającej 10 μL wody sterylnej. Powtarzaj łącznie co najmniej 5 probówek PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy) zawierających jelita różnych zwierząt.
13. Zamrozić rurki PCR w temperaturze -80 °C przez minimum 5 minut. Wyjmij probówki PCR z zamrażarki i rozmroź próbki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| 10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
| Igła BD PrecisionGlide - 26 G | Fisher Scientific | 305115 | |
| KH₂PO₄ | Fisher Scientific | P-286 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
| NH₄Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
| Streptomycyna | Millipore-Sigma | S6501-50G | |
| Tetracyklina | Millipore-Sigma | T7660-5G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
| Okulary zegarkowe | VWR | 470144-850 |
