Fluorescencja in situ Hybrydyzacja bakterii jelitowych w przekrojach jelit myszy

Streszczenie

Źródło: Ng, K. M., Tropini, C. Wizualizacja interakcji mikrobioty jelitowej z gospodarzem za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , barwienia lektynowego oraz obrazowania. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje procedurę hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w celu barwienia mikrobioty jelitowej w tkance jelitowej myszy poprzez hybrydyzację fluorescencyjnych sond do bakteryjnego rRNA (rybosomalnego kwasu rybonukleinowego) oraz przeciwbarwienie struktur gospodarza do analizy mikroskopowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etycznego przeglądu zwierząt

1. Barwienie bakteryjne FISH (hybrydyzacja in situ fluorescencyjną)
   1. Użyj blokera płynu lub PAP pen (hydrofobowego pena barierowego), aby ograniczyć obszar rozprzestrzeniania się cieczy, okrążając obszar każdego fragmentu tkanki. Upewnij się, że tusz nie styka się z samą sekcją. Stwórz okrąg jak najbliżej każdego przekroju tkanki, nie dotykając jej bez kontaktu z tkanką, aby zminimalizować powierzchnię potrzebną do pokrycia przez roztwór hybrydyzacyjny.
   2. Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny: na każde 50 μL roztworu wstępnie podgrzanego dodaj sondę o pojemności 0,5 μg (np. 0,5 μL sondy o pojemności 1 μg/μL). Pipetą przekład hybrydyzacji na przekrojach na szkiełku (~20 μL/przekrój, w zależności od rozmiaru przekroju/koła). Od tego momentu chroń roztwór hybrydyzacyjny i szkiełka przed światłem podczas inkubacji i przechowywania.
   3. Upewnij się, że objętość użytej cieczy pokrywa cały fragment po nałożeniu elastycznej plastikowej pokrywki. Inkubuj szkiełko w wilgotnej komorze, aby ograniczyć parowanie. Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem do pipety, z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi na dnie, które zostały nasączone nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego lub soli fosforanowej (PBS), aby zapewnić wilgotność. Inkubuj sekcje w temperaturze 45-50 °C, w zależności od zestawu sondy, przez >3 godziny.
   4. Podgrzej bufor płukania FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl do 50 °C podczas okresu inkubacji. Przygotuj wystarczająco dużo bufora do prania, żeby zakryć szkiełka w słoiku Coplin.
   5. Usuń plastikowe pokrywki; inkubuj szkiełki w buforze FISH w słoiku Coplin, oba podgrzane do 50°C. Włóż słoik Coplin z powrotem do piekarnika 50°C na 10-20 minut. W przypadku grubych próbek usuń pokrywki z słoika Coplin, dodając bufor i delikatnie je usuwając, aby uniknąć rozmazywania kawałka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Słoik Coplin	Fisher	08-813E
Szkło pokrywowe, 22 × 22 mm, nr #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Ponownie zawiesinowany do 5 mg/mL
Puste pudełka do końcówek pipety			Do topienia parafiny
Sondy FISH
Rozwiązanie hybrydyzacji FISH	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01% (w/v) SDS w wodzie wolnej od nukleazy. Opcjonalne dodanie formamidu 5–50% (v/v)
Bufor płukania FISH	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Lektin Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) znakowany fluorescencyjnie	Laboratoria Vector	FL-1061 (znakowany fluoresceiną) lub RL-1062-2 (znakowany rodaminą)	UEA-1 oznacza fukozylowane glikany, więc nie jest odpowiedni dla myszy wolnych od zarazków ani dla próbek gospodarzy z niedoborem fukozylotransferazy 2 (FUT2).
Kleszcze
Elastyczne plastikowe pokrywy HybriSlip, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	w etapach hybrydyzacji FISH można zastąpić szklane pokrywki
ImmEdge Hydrofobowy Barierowy Długopis PAP	Laboratoria Vector	H-4000
Kimwipes
Wielofunkcyjne pojemniki do przechowywania próbek, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Możesz zastąpić to wybranym pojemnikiem szklanym lub polietylenowym. Metakarn nie jest kompatybilny z polistyrenem ani metalem.
Lakier do paznokci	Nauki o mikroskopii elektronowej	72180	Każdy lakier do paznokci powinien się sprawdzić
Piekarnik			Zakres wymagany: 45-60 °C
PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanowo (10x roztworu)	Fisher	BP3991	Rozcieńcz do 1x dla protokołu
Chlorek sodu	Fisher	S271
Roztwór chlorku trizmy, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Woda, wolna od nukleazy	Fisher	BP2484100