Izolacja zewnętrznych pęcherzyków błonowych Legionella pneumophila oparta na ultrawirowaniu

Streszczenie

Źródło: Jung, A. L. i in. Pęcherzyki zewnętrznej błony Legionella pneumophila: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego u makrofagów. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje izolację zewnętrznych pęcherzyków błonowych (OMV) od Legionella pneumophila za pomocą sekwencyjnej wirowania, sterylnej filtracji oraz ultrawirowania. Oczyszczone OMV, wzbogacone o białka błonowe i lipopolisacharydy, nadają się do badań interakcji gospodarz-patogen.

Protokół

1. Hodować Legionella pneumophila

1. Rozsiej szczep szczepu L. pneumophila Corby (typ dziki, WT) na buforowanych płytach agarowych z ekstraktem drożdży drzewnych (BCYE) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 3 dni. Zaszczepić 10 mL bulionu z ekstraktem drożdżowym (YEB) przy przedawkowaniu₆₀₀ 0,3 z L. pneumophila z płyty prekulturowej; inkubuj bakterie w temperaturze 37 °C na obrotowym shakerze (150 rpm) przez 6 godzin.
2. Sprawdź czystość płynnej hodowli, rozprowadzając 100 μL zawiesiny na płytce agarowej z krwią. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj pozostałą płynną kulturę do 90 mL świeżego medium YEB i inkubuj na obrotowym shakerze (37 °C i 150 obr./min), aby uzyskać OD₆₀₀ 3,0-3,5, co zajmuje około 16-20 godzin.

2. Przygotowanie i ilościowe określenie pęcherzyków błony zewnętrznej L. pneumophila (OMV)

UWAGA: Wszystkie następujące etapy wirowania wykonuj w warunkach sterylnych i w temperaturze 4 °C.

1. Wiruj hodowlę cieczy w ilości 4 000 x g przez 20 minut, aby rozpylić bakterie. Przelej supernatant do świeżych rurek wirówkowych, wyrzuć granulki bakteryjne i powtórz wirowanie (4 000 x g przez 20 minut). Powtórz ten krok raz.
2. Sterylnie przefiltruj pozostały supernatant dwukrotnie (rozmiar porów: 0,22 μm). Przelej bezbakteriowy supernatant do rurek ultrawirówek i podaj ultrawirówkę w 100 000 x g przez 3 godziny.
3. Przelej supernatant i wyrzuć go. Ponownie zawiesijcie pellet OMV w sterylnej soli fosforanowej (PBS) i ultrawirówce (100 000 x g przez 3 godziny), aby usunąć zanieczyszczające białka i LPS.
4. Usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet OMV w 500 μL sterylnego PBS. Rozmazuj 20 μL na płycie agarowej z krwią oraz na płycie agarowej BCYE, aby wykluczyć zanieczyszczenie bakteryjne przygotowanych pęcherzyków. Inkubuj płytkę agarową z krwią przez noc, a płytę agarową BCYE przez 3 dni (oba w temperaturze 37 °C).
   UWAGA: Stężenie 100 mL hodowli L. pneumophila wynosi zwykle 1 μg/μL. Przygotowane i ilościowe OMV należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 cm szalki Petriego	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)	82.1473
Wirnik 70 Ti	Beckman Coulter Incorporation (Kalifornia, USA)	337922
Kuwetty	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)	67.742
Inkubator CO₂ Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)	75004515
Pętla inokulacji	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Niemcy)	L 1825
Obrotowy shaker (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Anglia)	80-2116-30
Filtr sterylny (por: 0,22 μm)	Corning Incorporated (Nowy Jork, USA)	431096
Węgiel aktywny	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	5210.2
Agar Columbia z 5% krwi owczej	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)	254005
Ekstrakt drożdżowy	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)	2363.2