Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Streszczenie

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Protokół

1. Izolacja i hodowla bakterii związanych z nicieniem (Rysunek 1)

1. Aby wyizolować bakterie, przygotuj płytkę z 96 dołkami z trzema sterylnymi kulkami o średnicy 1 mm, 20 μL buforu M9 minimalnych soli średniego (M9) na dołek i pipetować pojedynczego, umytego nicienia do każdego dołku, przelewając jak najmniej płynu.
   UWAGA: Alternatywnie, populacje robaków można wypłukać z płyt buforem M9, a ~300 μL buforu M9 zawierającego robaki można przenieść do probówek o pojemności 2 mL z 10-15 kulkami.
2. Rozbij nicienie za pomocą homogenizatora kulek (np. ubijanie koralików przez 3 minuty przy 30 Hz). Krótko wiruj płytę lub probówki, aby płyn dotarł do dna (np. przez 10 sekund przy 8000 x g w temperaturze pokojowej, RT).
   UWAGA: Zastosowanie tej metody doprowadziło do izolacji taksonów bakteryjnych podobnych do tych ujawnionych przez sekwencjonowanie amplikonów DNA rybosomalnego 16S (rDNA), co sugeruje, że opisane pobijanie koralików pozostawia większość komórek bakterii nienaruszoną.
3. Zbieraj supernatant, rozcieńczaj go seryjne w skali 1:10 i nakładaj do 100 μL na płytki agarowe o średnicy 9 cm.
   1. Aby zapewnić możliwość hodowli większości bakterii, należy stosować różnorodne alternatywne podłoża o różnych składnikach odżywczych, w tym rozcieńczony agar sojowy z tryptykazą (TSA, rozcieńczenie 1:10), agar MacConkey, agar glukozowy Sabouraud, agar z dekstrozą ziemniaczaną lub agar z drożdżami peptone.
4. Inkubuj płytki w warunkach średniej temperatury miejsca pobierania próbek (np. temperatury między 15-20 °C dla stref umiarkowanych) przez 24-48 godzin.
5. Użyj standardowej techniki trzech smugów oraz sterylnej pętli, aby uzyskać czyste kultury bakteryjne (Rysunek 1).
   1. Wybierz pojedynczą kolonię z płytki za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki i rozciągnij ją na nową płytkę agarową zawierającą ten sam nośnik agarowy, co używany do oczyszczania. Upewnij się, że używasz tylko około 1/3 talerza.
   2. Albo użyj nowej sterylnej pętli, albo wysterylizuj wielorazową pętlę i przeciągnij ją przez pierwszą smugę, aby stworzyć drugą smugę na kolejnej 1/3 tej samej płyty.
   3. Powtórz ten krok, przeciągając sterylną pętlę przez drugą smugę.
   4. Inkubuj płytkę w tych samych warunkach wzrostu, co w izolacji. Ta technika musi skutkować wzrostem pojedynczych kolonii w okolicach trzeciego pasma.
      UWAGA: Może być konieczne powtarzanie etapu oczyszczania wielokrotnie, ponieważ naturalne izolaty mają tendencję do tworzenia biofilmów i/lub agregatów.
6. Czyste kolonie uprawiaj w płynnym podłożu (tego samego typu co medium agarowe) przy tej samej temperaturze i czasie wzrostu co powyżej (krok 1.4)

Wyniki

Rysunek 1: Identyfikacja gatunków i izolacja poszczególnych bakterii. Pojedyncze nicienie są rozbijane za pomocą homogenizatora kulek, a DNA izolowane jest w celu określenia gatunku za pomocą PCR lub sekwencjonowania. Alternatywnie, rozbity mater...