$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Izolacja społeczności bakteryjnej wewnątrzkomórkowej (IBC): Pipetowanie IBC przez usta
UWAGA: Wszystkie metody opisane w tej sekcji przeszły instytucjonalną ocenę ryzyka. Pipetowanie ustne niesie ze sobą ryzyko spożycia przelewanego roztworu. To ryzyko jest w dużej mierze ograniczane przez nanolitrowe objętości, które wykorzystuje ten protokół, dlatego zalecamy wszystkim użytkownikom protokołu stosowanie się do notatek ostrożności i praktyki wymienionych tutaj oraz w dyskusji.
- Po zeskrobaniu komórek do PBS (soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) należy uruchomić aparat do mikropipetowania w jamie ustnej (Rysunek 1C).
- Włóż grubszy koniec wyciągniętego szklanego kapilary (niewyciągnięty koniec) do gumowego korka (białego końca) rurki aspiratora.
- Włóż wąski koniec końcówki pipety o pojemności 1 mL do drugiego otwartego (czerwonego) końca rurki aspiratora, zapewniając ciasne dopasowanie.
- Włóż wąski koniec pipety 2 mL aspirującej do otwartej, szerszej końcówki końcówki pipety 1 mL, ponownie zapewniając ciasne dopasowanie.
UWAGA: Powstały układ pozwala badaczowi na podanie pipety ustami z szerszego, otwartego końca pipety aspirującej, tworząc delikatną siłę ssania z wąskiego końca rurki kapilarnej na drugim końcu aparatu. - Przetestuj ostatnie urządzenie do mikropipetowania ustnego przy użyciu szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej świeżą, zdejonizowaną wodę. Delikatne działanie ssące na otwartym końcu pipety aspirującej (podobne do popijania napoju przez słomkę) powinno zwiększyć poziom płynu w kapilarze, ale nie powodować przelania się zdejonizowanej wody do rurki aspiratora. Jedną ręką kontroluj rurkę kapilarną, a drugą reguluj pozycję szalki Petriego.
UWAGA: Siła ssania wymagana do pipetowania ustnego pojedynczego IBC będzie się różnić w zależności od badaczy. Zaleca się jednak, aby każdy badacz próbujący tej techniki zaczynał od słabego ssania i stopniowo je zwiększał, jeśli nie płynie płyn w górę kapilary. Nie ma potrzeby siły większej niż ssanie słomki do picia. Jeśli kapilara nie wydaje się pobierać cieczy podczas testu w kroku 1.1.4, możliwe jest, że kapilara lub rurka aspirująca są zatkane i trzeba je wymienić. Zaleca się również, aby wszyscy nowi badacze najpierw przećwiczyli kontrolę ssania w urządzeniu pipetującym w ustach za pomocą sterylizowanej wody. Dodatkowo należy zauważyć, że kontrola głośności pobieranej przez aparat pipetujący ustami odbywa się za pomocą języka badacza. Język może precyzyjnie regulować siłę ssania, a także działać jako awaryjne zatrzymanie. - Po pomyślnym wchłonięciu cieczy sprawdź zdolność jej wydalenia z kapilary, delikatnie w otwarty koniec pipety zasysającej. Upewnij się, że podczas wydalania cieczy nie powstają pęcherzyki, aby zapobiec zanieczyszczeniu układów w trakcie 1.5.
UWAGA: Podobnie jak w przypadku ssania, siła dodatniego ciśnienia wywieranego przez badacza do wypchnięcia IBC do rury wirówki będzie się różnić w zależności od badaczy. Zaleca się, aby badacze nowi znaleźli ten protokół, aby praktykowali krok 1.1 na kilka dni przed faktycznym zakażeniem. Jedną z sugestii do praktykowania mikropipetowania w jamie ustnej jest ćwiczenie przenoszenia małych ilości sterylizowanej wody zmieszanej z kilkoma kroplami barwnika spożywczego (dla widoczności) za pomocą aparatu do mikropipety ustnej.
- Umieść zeskrobany zawiesin komórkowy pod mikroskopem rozcinającym i zidentyfikuj IBC jako duże agregaty fluorescencyjne (Rysunek 1A, B). Idealny zakres powiększenia to 20-40x. Zanurz cienki koniec szklanej kapilary w świeżej tubce PBS na 1 sekundę, aby zmniejszyć wchłanianie niepożądanej objętości przez działanie kapilarne.
- Patrząc przez mikroskop, zidentyfikuj interesujący się IBC i powoli zbliżaj otwarty koniec kapilary w stronę IBC. Użyj cienkiego końca szklanej kapilary, aby usunąć nadmiar komórek w pobliżu każdego śródbłonka płucnego, aby zapobiec aspiracji dwóch lub więcej komórek lub rozbić większe agregaty komórek.
- Podczas patrzenia przez mikroskop należy wystosować bardzo niewielką siłę ssania na dalekim końcu (pipetę aspirującą) aparatu do mikropipetowania ustnego, aby skierować IBC do szklanej kapilary.
- Po podniesieniu IBC przenieś kapilarę do pustej rurki wirówki 1,5 mL i przystosuj lekkie dodatnie ciśnienie, aby wypchnąć kroplę i IBC do rurki wirówki (rysunek 1D).
- Powtórz kroki 1.3-1.6 na tylu IBC, ile potrzeba z obecnego pęcherza, zanim przejdziesz do kolejnego pęcherza. Często zmieniaj pipety i naczynia włosowate zasysające do zasytania, aby zapobiec gromadzeniu się śliny.
UWAGA: Podczas pracy z zakaźnymi (lub klinicznymi) szczepami bakterii należy stale monitorować poziom roztworu w naczyniu włosowatym. Nie pozwól, by poziom płynu poddawanego pipetą przelał się z krawędzi kapilary do rurki aspiratora. Jeśli tak się stanie, natychmiast przełącz się na inną rurkę aspiratorową i odrzuć poprzednią instalację. - Powtarzaj kroki 1.2-1.6 na wszystkich pobranych pęcherzach lub do momentu zebrania wystarczającej liczby próbek biologicznych dla grupy eksperymentalnej.
- (Opcjonalnie) Powtarzaj kroki 1.6 i 1.7, aż wszystkie grupy eksperymentalne (lub myszy) zostaną uśpione i pobrano wystarczającą liczbę próbek biologicznych z każdej grupy.
