Wykrywanie ekspresji genów docelowych w mózgu myszy zakażonym bakteriami

Streszczenie

Źródło: Zhang, S. i inni. Śródczaszkowa droga zakażenia podpajęczynkowa do badania roli biofilmów Streptococcus suis w zapaleniu opon mózgowych w modelu zakażenia myszy. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje wykrywanie ekspresji genów docelowych w mózgu myszy zakażonej bakterią. RNA jest ekstrahowane, traktowane enzymem degradującym DNA i odwrócone transkrybować do cDNA. CDNA jest amplifikowane poprzez cyklowanie termiczne z primerami specyficznymi dla genów, podczas gdy barwnik wiążący DNA wiąże się z amplifikowanym DNA, emitując fluorescencję. Sygnały fluorescencji są analizowane, aby potwierdzić obecność docelowego genu.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii

Uwaga: Szczep serotyp 2 serokulentny Streptococcus suis (S. suis) P1/7 został wyizolowany z chorej świni z zapaleniem opon mózgowych. Szczep P1/7 był hodowany w bulionie Todd-Hewitt (THB, formuła na litr THB: Infuzja serca, 3,1 g; neopepton, 20,0 g; dekstroza, 2,0 g; chlorek sodu, 2,0 g; fosforan dissodowy, 0,4 g; węglan sodu, 2,5 g) i pokrycie na agarze Todd-Hewitt (THA, formuła na litr THA: infuzja serca, 3,1 g; neopepton, 20,0 g; dekstroza, 2,0 g; chlorek sodu, 2,0 g; fosforan dissodu, 0,4 g; węglan sodu, 2,5 g; agar, 15,0 g) w temperaturze 37 °C i 5%_CO2.

1. Zebranie komórek planktonicznych szczepu P1/7
   1. Pobierz 5 mL komórek planktonicznych z hodowli w fazie średniej logariatusu (OD₆₀₀=0,6), wiruj przez 3 minuty przy 8000 × g, a następnie przepłukaj 3 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
   2. Ponownie zawiesij komórki z 5 mL 25% glicerolu w THB, podaj do 5 probówek i przechowuj w temperaturze -80 °C.
2. Zbieranie komórek stanowych szczepu P1/7
   1. Weź 20 mL hodowli nocnej i dodaj do 180 mL świeżego THB; Rozcieńczoną hodowlę podziel równomiernie na 10 okrągłych płytek hodowlanych, a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 na 24 godziny.
   2. Po inkubacji delikatnie potrząśnij płytką, aby ponownie zawiesować bakterie, które nie przykleiły się do płyty, a następnie wyrzuć supernatant przez aspirację.
      UWAGA: Delikatnie potrząsaj płytą i unikaj ponownego zawieszania osadów.
   3. Dodaj 5 mL PBS, aby pobrać komórki stanu biofilmu, całkowicie zawiesz osad, a następnie przenieś próbkę do nowej probówki.
   4. Sonikować komórki w stanie biofilmu od ostatniego etapu według następujących parametrów: 60 W, 4 cykle, 5 sekund włączone i 10 sekund wyłączone.
   5. Wiruj przez 3 minuty w 8000 × g i przechowuj supernatant w -80 °C.
      UWAGA: Supernatant może zawierać składniki biofilmu i może być używany do ponownego zawieszenia bakterii biofilmowej przed infekcją, jak opisano w eksperymentach na zwierzętach (Krok 2).
   6. Ponownie zawiesić osad z 10 mL 25% glicerolu w THB, a następnie przechowywać komórki w stanie biofilmu w temperaturze -80 °C.

2. Eksperymenty na zwierzętach

1. W tym badaniu użyj 6-tygodniowych samic myszy BALB/c z filtrem SPF. Zainfekowaj wszystkie myszy przez śródczaszkową drogę podpajęczynczynową zakażenia, której miejsce wstrzyknięcia znajduje się 3,5 mm od brzegmy.
   1. Do analizy histopatologicznej zainfekuj dwie grupy myszy (5 myszy na grupę) za pomocą komórek planktonowych lub komórek stanu biofilmu w dawce 3 × 10 7 jednostek kolonii (CFU), a kolejne 5 myszy zostało wstrzykniętych PBS jako kontroli.
   2. Aby wykryć ekspresję mRNA TLR2 i cytokin w mózgu, należy zainfekować dwie dodatkowe grupy myszy (6 myszy w grupie) za pomocą komórek planktonowych lub komórek stanu biofilmowego w dawce 3 × 10⁷ CFU.
   3. Określ liczbę żywotnych bakterii, nakładając na THA seryjne rozcieńczenia.
   4. Uśpij wszystkie myszy 12 godzin po infekcji w celu dalszych badań. ​
      UWAGA: Glicerol z podłoża wywartego należy usunąć przed infekcją. Zarówno komórki planktonowe, jak i komórki w stanie biofilmu odzyskane z temperatury -80 °C są myte 3 razy PBS. Następnie komórki planktoniczne są ponownie zawieszane w PBS i rozcieńczane do odpowiedniej dawki dla zakażenia; Komórki stanu biofilmowego są ponownie zawieszane wraz ze zgromadzonym supernatantem (od etapu 1.2.5) i rozcieńczane do odpowiedniej dawki dla zakażenia. Objętość do zakażenia nie powinna przekraczać 50 μL.
2. Wykrywanie ekspresji mRNA TLR2 i cytokin w tkance mózgowej
   1. Całkowite RNA należy pobrać z tkanki mózgowej za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
      1. Dla każdej myszy wykorzystaj całą tkankę mózgową do ekstrakcji RNA. Podziel całą tkankę mózgową na 5 rurek. Weź do 100 mg tkanki mózgowej i dodaj 1 ml roztworu lizycznego do każdej probówki zawierającej matrycę lizującą dostarczoną przez zestaw.
      2. Przetworz probówkę w homogenizatorze przez 40 sekund przy ustawieniu 6,0, a następnie wiruj ją w 12000 × g i 4 °C przez 5 minut.
      3. Po wirowaniu przenieś górną fazę do nowej rurki mikrowirówki.
      4. Inkubuj przeniesioną próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej; Dodaj 300 μL chloroformu, zachowuj wir przez 10 sekund, a następnie inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      5. Wiruj probówkę w 12000 × g i 4 °C przez 5 minut. Przenieś górną fazę do nowej rurki.
      6. Dodaj 500 μL zimnego etanolu absolutnego do probówki przed odwróceniem jej 5 razy, a następnie przechowuj próbkę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
      7. Wiruj rurkę w 12000 × g i 4 °C przez 15 minut i usuń supernatant. Przemyj pellet 500 μL zimnego, 75% etanolu w wodzie wolnej od RNazy (_H2O).
      8. Usuń etanol, susz granulat na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesij RNA w 100 μL H_2Owolnego od RNazy.
      9. Inkubuj RNA przez 5 minut w temperaturze pokojowej i określaj stężenie RNA za pomocą bioanalizatora RNA.
   2. Wykonaj syntezę DNA komplementarnego (cDNA), w tym eliminację DNA genomowego (gDNA), przy użyciu termocyklera z zestawem odczynnika do transkrypcji odwrotnej (RT).
      1. Dodaj 1 μg RNA do probówki zawierającej 2 μL buforu eliminacyjnego 5x gDNA, 1 μL enzymu eliminacyjnego gDNA oraz wolnego od RNazy_H22Oaż objętość osiągnie 10 μL. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 42 °C.
      2. Dodaj 10 μL mieszanki głównej (1 μL mieszanki enzymu RT I, 1 μL mieszanki zapalniczej RT, 4 μL mieszanki 5x Buforu 2 oraz 4 μL bezrezowej H₂O) do roztworu reakcyjnego z ostatniego etapu, a następnie delikatnie wymieszaj. Natychmiast przeprowadzić reakcję RT: 37 °C przez 15 minut, a następnie 85 °C przez 5 sekund.
      3. Wykonaj ilościową analizę reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) za pomocą maszyny PCR w czasie rzeczywistym z zestawem SYBR RT-qPCR. Dodaj 10 μL enzymu 2x, 0,8 μL startera do przodu, 0,8 μL odwróconego primeru, 0,4 μL 50x ROX Reference Dye II, 2 μL cDNA oraz wolnego od RNazy H_2Odo całkowitej objętości 20 μL.
      4. Każdą próbkę należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach według następujących parametrów termicznych: 30 s przy 94 °C, następnie 40 cykli po 5 s przy 95 °C oraz 34 s przy 60 °C, z końcowym etapem 15 s przy 95 °C, 1 min przy 60 °C oraz 15 s przy 95 °C. Spłony RT-qPCR wymieniono w Tabeli 1. Geny housekeeping B2m i rRNA 18s były wykorzystywane jako wewnętrzne kontrole.
   3. Oblicz względną zmianę fałdów na podstawie metody ^2-ΔΔCt .

Tabela 1: Spłony dla RT-qPCR.

Nazwa początkowa	Sekwencja (5'-3')	Symbol genu
IL-6 forward	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
Tył IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 do przodu	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
TLR2 wsteczna	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Napastnik CCL2	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
Wsteczny CCL2	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α naprzód	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
TNF-α wsteczna	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m do przodu	GGTCTTTGTGGTGCTGTGTCT	B2m
β2m rewers	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18 sekund do przodu	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18 sekund odwrotnie	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion Todda Hewitta (THB)	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	Rozpuść 30 g proszku w 1 litrze oczyszczonej wody. Autoklawuj pod kątem 121° przez 15 minut.
Agar	DSBIO	16C0050	Rozpuść 15 g proszku w 1 L THB. Autoklawuj pod kątem 121° przez 15 minut.
Referencyjny System Oczyszczania Wody Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Bez Dnase/ Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glicerol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Rozcieńczony z równą objętością oczyszczonej wody, autoklawowany pod kątem 121° przez 15 minut
4% paraformaldehydu	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25% glutaraldehydu	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	10 razy rozcieńczone oczyszczoną wodą dla utrwalenia.
Etanol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Chloroform	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Spctrofotometr	DeNovix Inc.	DS-11+
Zgniatarka komórek ultrasonograficznych	NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd	JY96-IIN
Wirówka	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Lodówka	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
Zestaw FastRNA Pro Green	MP Biomedicals	#6045-050
FastPrep-24 Instrument	MP Biomedicals	116005500
Instrument do PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
Zestaw reagentów PrimeScript RT z gDNA Eraser	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A