Ilościowe określenie wydzielania bakteryjnego w celu oceny potencjału transmisji infekcji u Drosophila

Streszczenie

Źródło: Siva-Jothy, J. A. i in., Infekcja bakteryjna jamy ustnej i wypadanie u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje procedurę monitorowania wydzielania bakterii u Drosophila poprzez przenoszenie zakażonej muchy przez kilka rurek zawierających pokarm, odzyskiwanie odpadających bakterii oraz ilościowe określenie żywotnych kolonii poprzez seryjne rozcieńczanie i nabijanie płyt.

Protokół

1. Mierz wydzielanie bakteryjne
   1. Mierz zrzucenie się wraz z obciążeniem wewnętrznym.
   2. Po zakażeniu należy przenieść pojedyncze muchy do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL zawierających ~50 μL pożywki Lewisa na 24 godziny.
   3. Usuń muchy do pomiaru ładunku wewnętrznego i przemyj rurki 100 μL 1x PBS (fosforanową buforowaną solą fizjologiczną) przez intensywne wirowanie przez 3 sekundy.
   4. Zmierz CFU (jednostki tworzące kolonie) w tym płukaniu, pokrywając warstwę na agarze LB (Luria-Bertani).
   5. Po zakażeniu należy przenieść pojedyncze muchy do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL zawierających ~50 μL pożywki Lewisa na 24 godziny.
   6. Przełóż muchy do nowych mikrowirówek zawierających ~50 μL medium Lewisa na kolejne 24 godziny. Przemyj skażone rurki 100 μL 1x PBS, mocno wirując przez 3 sekundy.
   7. Zmierz CFU w tym washu, nakładając na LB agar z odżywkami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolki	Sarstedt Ltd.	58.49	Rurka z płaskim spodem polistyrenu 75mm x 23,5mm, 23ml
Agar	Sigma-Aldrich	A7002	Agar, popiół 2,0-4,5%
Brązowy cukier	Bidvest	66032	Jasnobrązowy miękki cukier
Kukurydza	Dove's Farm		Mąka kukurydziana organiczna
Drożdże fermipanowe	Bidvest	96360	Suche, natychmiastowe drożdże
Szalki Petriego	Fisher Scientific UK Ltd.	15788517	X600 Dish Petriego 90 x 16,2MM sterylny potrójny wentyl
Tubka Eppendorfa (1,5 ml)	Sarstedt Ltd.	72.690.001	Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1,5 ml Standard Neutral
Etanol	VWR International Ltd.	20821.33	ETHANOL ABSOLUT ANALAR NP ACS/R.PE - Klasa analityczna
Bulion LB, Miller	Fisher Scientific UK Ltd.	BP1426	Zawiera 10g tryptonu, 5g ekstraktu drożdżowego, 10g chlorku sodu na litr
Mikropłytka 96-dołkowa	Scientific Laboratory Supplies Ltd.	353072	Falcon 96 dołków z przezroczystym płaskim dnem TC-impregnowanym mikropłytą do hodowli komórek polistyrenowych z pokrywką sterylną
Wir	Fisherbrand		Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Końcówki pipety 10 μL	Greiner Bio-one Inc	741015	Łatwo w stylu Gilsona. Ukończone, przezroczyste, uzupełnione, 960 pcs
Końcówki pipety o pojemności 200 μL	Greiner Bio-one Inc	741065	Łatwo w stylu Gilsona. Ukończone, przezroczyste, uzupełnione, 960 pcs
Końcówki pipety o masie 1000 μL	Greiner Bio-one Inc	741045	Łatwo w stylu Gilsona. Ukończone, przezroczyste, uzupełnione, 960 pcs
20 μL filtrowane końcówki pipet	Greiner Bio-one Inc	774288	Końcówka filtrująca w stylu Gilsona. Przezroczysty, niebieski w ramie, pojedyncze, bez R/Dnase, 10 racków po 96 części
200 μL filtrowane końcówki pipet	Greiner Bio-one Inc	739288	Końcówka filtrująca w stylu Gilsona. Przezroczysty, niebieski w ramie, pojedyncze, bez R/Dnase, 10 racków po 96 części
1000 μL Filtrowane końcówki pipety	Greiner Bio-one Inc	740288	Końcówka filtrująca w stylu Gilsona. Przezroczysty, niebieski w półkach, pojedyncze, bez R/Dnase, 10 racków po 60 części