Dostarczanie w aerozoli Mycobacterium tuberculosis w leczeniu infekcji płuc w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Mueller, A. i in. Model eksperymentalny do badania współzakażenia gruźlicą i malarią przy naturalnym przenoszeniu Mycobacterium tuberculosis i Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)

Ten film demonstruje aerozolowe dostarczanie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) do myszy za pomocą systemu komor opartych na nebulizatorze, aby wywołać infekcję płuc, dostarczając kontrolowany i powtarzalny model do badania transmisji gruźlicy drogą powietrzną oraz interakcji gospodarza z patogenem in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Zakażenie aerozolem myszy Mtb przy użyciu komory aerozoli Glas-Col

Najlepszym sposobem standaryzacji zakażenia aerozolem zwierząt eksperymentalnych Mtb (Mycobacterium tuberculosis) jest wykorzystanie mykobakterii z mrożonych zapasów o znanych miaczach CFU (jednostki tworzące kolonie). Aby przygotować hodowle stockowe, stosuje się hodowlę Mtb w bulionie Middlebrook 7H9 wzbogaconym OADC (kwas oleinowy, albumina, dekstroza, katalaza) oraz 0,05% Tween 80, źródło węgla dla mykobakterii, a jednocześnie stosuje się środki zapobiegające zgrudkowianiu bakterii. Hodowle powinny mieć gęstość optyczną (OD) ≤ 1 w momencie zbioru. Przy wyższym przedawkowaniu zgrudkowań bakterii rośnie, a żywotność maleje. Przechowuj 1 ml aliquotów w temperaturze -80 °C. Określ liczbę żywotnych CFU w zamrożonych zapasach, nakładając serię 10-krotnych rozcieńczeń trzech niezależnych fiolek na płytach agarowych 7H11 z dodatkiem 0,5% gliceroli, 1 g/l asparaginy i OADC oraz wyliczając kolonie po 4 tygodniach inkubacji w 37 °C. Przeprowadz infekcję aerozolem, jak opisano poniżej.

1. Rozmraź zapasy Mtb znanego miana CFU i ostrożnie wymieszaj zawiesinę pięć razy, aby rozproszyć grudki bakteryjne, używając strzykawki 1 ml wyposażonej w igłę 27 G. Unikaj produkcji aerozoli.
2. W zależności od pożądanej dawki infekcji, należy przenieść wymaganą objętość zapasu grzybniczego do probówki 50 ml zawierającej jałową, buforowaną fosforanami soli fizjologicznej (PBS). Ostatni tom to 6 ml.

UWAGA: Zmieniając liczbę mikroorganizmów w tej zawiesinie, zmienia się udział bakterii zawierających kropelki aerozolu. Zazwyczaj dążymy do wychwytu 100 żywotnych pałeczek na płuco (zakażenie w niskiej dawce). Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba około 1-2 × 10⁶ Mtb/ml w całkowitej objętości 6 ml, z czego 5,5 ml jest nebulizowanych. Zaleca się przeprowadzenie serii eksperymentalnych wyzwań aerozolistych z różnym stężeniem bakterii, aby znaleźć idealne warunki dla infekcji. Podczas gdy zakażenia wysokimi dawkami z udziałem do 5 000 grzybników mogą być przeprowadzane, aby przyspieszyć proces zakaźny, do skutecznego zakażenia myszy aerozolem można użyć zaledwie 5 bakterii. Wskaźnik zakażeń jest zazwyczaj 100%.

3. Usuń wystarczającą objętość (przygotowaną powyżej wymaganej objętości końcowej) do pokrycia w celu określenia miana inokulum; Zazwyczaj usuwamy 500 μl, aby płytować techniczne potrójne egzemplarze.
4. Umieść zwierzęta w koszyku z siatki na przedziałki (jedna mysz na koszyk) wewnątrz okrągłej komory aerozoli i zamknij pokrywę komory aerozolu.

UWAGA: Inne modele wyposażone są w kosz w kształcie ciasta składający się z pięciu oddzielnych przegródek, z których każdy może pomieścić 20 myszy.

5. Przymocuj jednostkę nebulizatora Venturiego do trzech stawów nasadek ze stali nierdzewnej.
6. Usuń zawiesinę mykobakterialną z probówki 50 ml strzykawką 10 ml wyposażoną w igłę 18 g i przenieś strzykawkę do komory aerozoli w zamkniętej skrzynce transportowej.
7. Zdejmij nakrętkę z urządzenia nebulizatora i ostrożnie wstrzykni zawiesinę mykobakterii do nebulizatora. Unikaj powstawania aerozoli. Wyrzuć strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty zawierające 2% Buratonu. Uszczelnij nebulizator nakrętką.
8. Włącz główny włącznik zasilania i lampę UV. Na wyświetlaczu klawiatury sterującej widnieje "Glas-Col Apparatus Co".
9. Włącz przełącznik programu. Wyświetlacz pokaże "Czy nebulizator jest gotowy?" "Czy koszyk jest załadowany?" Naciśnij enter, gdy będziesz gotowy. Naciśnij enter.
10. Wyświetlacz pokazuje "Enter Preheat Time 900"; oznacza to, że czas nagrzewania spalarni (która zanieczyszcza powietrze wylotowe) wynosi 900 sek. Naciśnij Enter.
11. Wyświetlacz pokaże "Enter Nebulizing time 1,800"; oznacza to, że czas nebulizacji jest ustawiony domyślnie na 1800 sekund. Aby wydłużyć czas nebulizacji, wpisz "2,400" i naciśnij enter.

UWAGA: Podczas cyklu nebulizacji powietrze pod ciśnieniem atomizuje zawiesinę, tworząc tym samym małe krople aerozoli zawierające mykobakterie. Dzięki głównemu przepływowi powietrza krople te (około 2-5 μm o wielkości) są wprowadzane do komory aerozolu.

 

12. Wyświetlacz pokaże "Enter C.D. Time 1,800"; oznacza to, że cykl rozpadu trwa 1800 sekund. Ustaw "2,400" i naciśnij Enter.

UWAGA: W trakcie tego cyklu chmura, która nagromadziła się w komorze aerozoli podczas cyklu nebulizacji, może się rozpadać. Małe krople są wdychane przez zwierzęta doświadczalne.

13. Wyświetlacz pokaże "Enter Grud Time 900"; oznacza to, że cykl dekontaminacji światłem UV potrwa 900 sekund. Naciśnij enter. Maszyna zacznie cykliczne procesy pregrzewania, nebulizacji, rozkładu chmur i dekontaminacji UV.
    UWAGA: Przepływomierz próżniowy powinien wskazywać 60 stóp sześciennych/godzinę (sprawdź, kiedy zaczyna się cykl wstępnego nagrzewania; w razie potrzeby wyreguluj zawór kontroli podciśnienia), a miernik przepływu sprężonego powietrza 10 stóp sześciennych/godzinę (sprawdź rozpoczęcie cyklu nebulizacji; odpowiednio dostosuj zawór kontroli powietrza).
14. Po zakończeniu cyklu klawiatura wyświetla "Proces zakończony – Usuń próbkę". Wyłącz program, UV i główny włącznik zasilania.
15. Sprawdź, czy zawiesina mykobakterialna została całkowicie nebulizowana, a jeśli nie, zapisz pozostałą objętość, ostrożnie usuwając zawiesinę odpowiednią strzykawką z igłą 18 G. Pozostała objętość nie powinna przekraczać 1 ml.
16. Wyjmij nebulizator ze stawów i umieść go w naczyniu zawierającym 2% Buratonu na minimum 2 godziny, zwykle dezynfekcja odbywa się po godzinie. Następnie przelej nebulizator do świeżej patelni i dokładnie przepłucz wodą. Zostaw nebulizator do wyschnięcia na powietrzu.
17. Otwórz komorę aerozolową i odłóż zwierzęta do ich klatek. Pakuj kosze do worków z autoklawem i autoklawem. Wytrzyj powierzchnie wnętrza komory aerozolu 2% Buratonem.

UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa podczas tego zabiegu należy nosić zasilany aparat oczyszczający powietrze.

18. Wykorzystując pozostałe 500 μl zawiesiny mykobakterii (patrz krok 1.3), 10-krotne rozcieńczenia technicznego potrójnego (3 x 100 μl) na płytach agarowych 7H11.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Buraton	Schülke		Składniki czynne: aldehydy (formaldehyd, glutaraldehyd, szczawaw, etylheksanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Dla kultur bulionu Mtb
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Medium agarowe do kultury Mtb
Medium-wzbogacanie OADC Middlebrook	BD Biosciences	212240	Dodaj do 7H9 i 7H11 dla kultury MTB
System narażenia na inhalacje	Glas-Col
Nebulizer-Venturi	Glas-Col