$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Szczepienie Pseudomonas aeruginosa
- Rozcieńcz nocną hodowlę PAO1:lux do OD600 = 0,05 w 75 mL podłoża Lysogeny (LB) zawierającego 100 μg/mL karbenicyliny i hoduj bakterie aż do wczesnej fazy wykładniczej (OD600≈0,3). Powinno to zająć około 2–3 godziny.
- Rozcieńcz PAO1:lux w fosforanowej soli buforowanej fizjologicznej (PBS) do stężenia (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Upewnij się, że przygotujesz nadmiar inokulum, aby zapewnić odpowiednią objętość i umożliwić nakładanie po eksperymencie. W przypadku transportu między obiektami stosuj podwójne zabezpieczenia w szczelnie szczelnym pudełku oznaczonym jako Biohazard.
- Wszystkie prace z P. aeruginosa i myszami wykonuj z użyciem zatwierdzonego sprzętu ochrony osobistej w szafce bezpieczeństwa biologicznego Animal Biosafety Level 2 (ABSL-2) zatwierdzonej (BSC). Urządzenia wielokrotnego użytku, takie jak waga, powinny być przykryte folią spożywczą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
- Znieczulaj mysz za pomocą 3% izofluranu. Zważ mysz i zapisz wagę. Podskórnie wstrzyknąć myszy podskórnie podgrzaną, sterylną zawartość 0,9% chlorku sodu, 250 μL na każdym boku, co daje łącznie 500 μL.
- Jeśli przezroczysty opatrunk folii myszy zszedł z dnia na dzień, ostrożnie usuń powstałe strupy i nałóż nowy opatrunk.
- Użyj strzykawki z kapturą gruźlicyny 27 G, aby wstrzyknąć 40 μL zawiesiny PAO1:lux przez przezroczystą folię do każdej rany. Do kontroli ran niezaszczepionych/PBS należy stosować różne myszy, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu po stronie przeciwległej.
- Umieść mysz z powrotem w klatce na termoforze i monitoruj, aż się obudzi. Wszystkie myszy powinny być trzymane osobno w osobnych klatkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
- Umieść wysokokaloryczną pastę z suplementami diety umieszczoną między granulkami jedzenia na podłodze klatki.