Izolacja bakterii z jelita śródżałowego komarów

Streszczenie

Źródło: Liu, X. i inni. Bakteryjny test żywienia ustnego z komarami leczonymi antybiotykami. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje rozwarstwienie jelita śródżałowego komara w celu wyizolowania bakterii jelitowych. Jelita środkowe jest pobierane z przewodu pokarmowego, homogenizowane, aby uwalniać bakterie, i nakładane na agarze odżywczym w celu hodowli kolonii bakterii.

Protokół

1. Rozpatrz śródjelito komarów
   1. Przenieś powierzchniowo sterylnego komara na szkiełko za pomocą kropli sterylnej soli fosforanowej (PBS) z buforem 1x. Rozciń pod mikroskopem rozcinającym.
   2. Pod mniejszym powiększeniem mikroskopu secującego, ostrożnie usuń nogi, skrzydła i głowę komara, aby zapobiec ucieczce. Usuń ostatni somit komara, tnąc go bezpośrednio, zamiast wyrywać, aby zapobiec pęknięciu przewodu pokarmowego.
   3. Zacisnąć klatkę piersiową komara i koniec jamy brzusznej kleszczemi. Delikatnie wyciągnij przewód pokarmowy komara. Nabyte przewody pokarmowe zwykle zawierają jelita przednie, jelita środkowego, tylnego oraz rurki Malpighiego.
   4. Ustawij mikroskop sekcjonujący na większe powiększenie. Usuń roślinę, przednie jelito, jelito tylne i rurki Malpighiego z rozciętego przewodu pokarmowego, aby uzyskać jelito śródkomórkowe komara.
   5. Uważaj podczas usuwania plonu, ponieważ plon narasta i przypomina śródjelito po spożyciu cukru przez komara. Rurki Malpighiego, czyli grupa długich i cienkich rur wydalniczych, znajdują się na granicy między jelitem środkowym a tylnym.
2. Izoluj bakterie jelitowe
   1. Przenieś rozcięte jelito środkowe do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL z 200 μL sterylnego buforu 1x PBS.
   2. Dokładnie zmiel śródjelito na sterylnym stole sterylnym tłuczkiem, aby umożliwić całkowite uwolnienie bakterii jelitowych do bufora.
   3. Rozcieńcz homogenat seryjnie do trzech 10-krotnych rozcieńczeń. Dodaj 50 μL każdej rozcieńczonej dawki na płytkę agarową LB (bulion Luria) i rozprowadz ją na talerzu. Jeśli jelito śród zawiera wysokie stężenie flory jelitowej, konieczne jest przeprowadzenie większej liczby rozcieńczeń w celu wyodrębnienia pojedynczych kolonii.
   4. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 1–2 dni, aż pojawią się pojedyncze kolonie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aedes aegypti			Samice komarów
Rurka wirówkowa	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 mL, naturalne, stopniowe, sterylne
Jednorazowy tłuczek do mielenia chusteczek	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm długości, stożkowa, niebieska, sterylna
Kleszcze	Napęd na tylne koła	F11029	Sekcja
Proszek agarowy LB	Sangon Biotech	A507003	Trypton 10,0 g, ekstrakt drożdżowy 5,0 g, NaCl 10,0 g, agar 15,0 g.
Mikroskop	Zeiss	Stemi508
Bufor PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Ten produkt to rozwiązanie 10X. Proszę rozcieńczyć go 10 razy przed użyciem. Wartość pH wynosi 7,4.