Obrazowanie na żywo śmierci komórek makrofagów podczas infekcji mykobakterią w zarodkach danio dano pręgowanego

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Niu, L. i in. Wizualizacja śmierci limfocytów makrofagów podczas zakażenia mykobakteriami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii śródwitalnej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii konfokalnej wewnątrzżyciowej do wizualizacji litycznej śmierci komórek makrofagów u zarodków danio pręgowanego po zakażeniu Mycobacterium marinum .

Protokół

1. Obrazowanie na żywo infekcji

1. Montaż ryb do obrazowania na żywo
1. Przenieś do 10 zarodków znieczulonych tricainą do środka szklanej miski o wymiarach 35 mm. Usuń nadmiar E3 medium.
2. Przykryj naczynie agarozą o niskiej temperaturze topnienia o 1% i ostrożnie ukierunkuj zarodki danio pręgowanego igłą 10 G. Inkubuj szklaną miskę na lodzie przez 10 sekund, aby agaroza się stwardniała.
  UWAGA: Do zastrzyków z śródmózgu zarodki powinny być zamontowane w agarozie z głową skierowaną ku górze (Rysunek 1A).
3. Gdy całkowicie zastygnie, przykryj agarozę warstwą wody jajowej (plus 1 x tricainy i PTU (N-fenylomocuru)).
Trójkolorowa wysokorozdzielcza mikroskopia czaspoklatkowa konfokalna
UWAGA: Następujące kroki wykonuje się na mikroskopie konfokalnej wyposażonej w obiektyw UV olejowy o wymiarach 63,0 x 1,40.
1. Ustaw temperaturę komory środowiskowej na 28,5 °C. Włóż do komory mokrą bibułę, aby zapewnić wilgotność i zapobiec parowaniu wody z jaj.
2. Umieść szklaną miską na dnie o średnicy 35 mm razem z danio dano w komorze środowiskowej.
3. Otwórz oprogramowanie konfokalne i zainicjalizuj etap. Przełącz się na obiektyw UV oleju 63,0 x 1,40 i zlokalizuj danio za pomocą kanału jasnego pola z filtrem różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC).
4. Otwórz diodę 405, Argon (20% mocy) i laser DPSS 561 nm. Ustaw odpowiednie ustawienia mocy lasera i spektrum.
  UWAGA: Poniżej przedstawiono ustawienia widma dla Cerulean (wzbudzenie = 405 nm; emisja = ~456–499 nm), eGFP (wzbudzenie = 488 nm; emisja = ~500–550 nm), DsRed2 (wzbudzenie = 561 nm; emisja = ~575–645 nm)
5. Wybierz tryb akwizycji "XYZ" "Sequential Scan" i ustaw format obrazu na "512 x 512 pikseli".
6. Przełącz się na "Tryb Live Data". Celuj w pozycję pierwszego danio i zaznacz pozycję "Początek" oraz "Koniec" Z. Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków. Na końcu programu można dodać "pauzę".
7. Zdefiniuj pętlę i cykl programu.
8. Zapisz plik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Montaż zarodków danio pręgowanego do obrazowania na żywo. (A) W przypadku zakażenia śródmózgowia zarodki danio były montowane z głową skierowaną w dół. (B) W przypadku infekcji obszaru pnia...