Ocena in vitro zabijania bakterii przez fagocyty śledziony noworodków myszy

Streszczenie

Źródło: Seman, B. G., et.al. Model obrazowania noworodków sepsy bakteryjnej Gram-ujemnej. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje izolację neutrofilów i zapalnych monocytów z noworodkowych śledzion myszy oraz ich zastosowanie w luminescencyjnym teście zabijającym bakterie. Obejmuje mechaniczną dysocjację, lizę czerwonych krwinek, wzbogacanie komórek oparte na kulkach magnetycznych, inkubację bakterii oraz ochronę antybiotykową. Pomiary luminescencji czasowej wskazują na początkową internalizację bakterii, po której następuje immunologiczne oczyszczanie.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etyki zwierząt.

1. Test zabijania bakterii in vitro

1. Usuń śledzionę z niezakażonego noworodka i umieść ją w nylonowym koszyku o średnicy 40 μm w sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm. Powtarzając to i zbieramy śledziony w jedną rurkę, która zostanie zebrana i ujednolicona.
2. Dodaj 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z dodatkiem 10% surowicy bydła płodu (FBS).
3. Rozłóż tkankę za pomocą sterylnej tłoka strzykawkowej o pojemności 3 mL, aż powstanie zawiesina pojedynczej komórki.
4. Zbieraj zawiesinę jednokomórkową spoza koszyka nylonowego, przelej do rurki wirówki 15 mL i wkładaj ogniwa do pelletów w ilości 350 x g przez 5 minut.
5. Zawiesz komórki w buforze lizy czerwonych krwinek (2 mL dla do 7-8 śledzion) i pozostawij je na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować erytrocyty.
6. Płucz splenocyty PBS i pelletami, jak wyżej.
7. Zawiesz splenocyty w 0,25 mL PBS uzupełnionym 0,5% BSA i 2 mM EDTA zgodnie z przewidywaną wydajnością komórek.
8. Policz splenocyty za pomocą hemocytometru lub innego odpowiedniego zastosowania.
9. Izoluj komórki Ly6B.2⁺ (populacja szpikowa granulocytów/monocytów zapalnych) za pomocą kulek immunomagnetycznych.
10. Rozsiewaj komórki Ly6B.2⁺ o gęstości 1 x 10^{5 komórek na} dołek w czarnej lub białej płytce z 96 dołkami w objętości 0,1 mL DMEM zawierającej 10% FBS, 2 mM glutaminy oraz 25 mM HEPES (kompletne medium).
11. Wylicz bioluminescencyjną E. coli i przygotuj szczepienie bakteryjne przy pożądanej wielokrotności zakażenia (MOI) w końcowej objętości 0,1 mL. Najlepiej robić to, co konieczne dla wszystkich studni w wspólnym MOI w partii.
12. Dodaj 0,1 mL szczepionki bakteryjnej lub kompletnego medium jako kontrolę. Inkubuj płytę wielodołową w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 przez 1 godzinę.
13. Zamień medium na 0,2 mL świeżego, kompletnego medium zawierającego gentamicynę (100 μg/mL), delikatnie usuwając medium pipetą i dodając świeże media nową końcówką pipety. Przywróć hodowlę do inkubacji na dodatkowe 2 godziny.
14. Po 3 godzinach po infekcji mierz luminescencję w każdym dołku płytki z pokrywką od dołu za pomocą czytnika płytek, a następnie przywróć hodowlę do inkubacji.
15. Powtórz pomiary luminescencji w innych pożądanych punktach czasowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor lizy ACK	Gibco	LSA1049201	Badanie usuwania bakterii
Mikrokulki anty-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Izolacja komórek
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (wyraża lucyferazę)	Nie ma	Nie ma	Zbudowany wewnętrznie w WVU
Bufor izolacji	Miltenyi Biotec	Nie ma	Badanie usuwania bakterii
LB Broth, Lennox	BioReagenty Fishera	BP1427-500	Wzrost bakterii
EASYstrainer (koszyk nylonowy)	Greiner Bio-one	542 040	Sitnik komórkowy
SpectraMax iD3	Urządzenia molekularne	Nie ma	Czytnik tablic