Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie szczepionki bakteryjnej
- Skrzyżuj płytkę tryptycznego agaru sojowego (TSA) z pętlą inokulacyjną, aby izolować pojedynczą kolonię z zamrażarki Escherichia coli O1 :K1:H7-lux , która stabilnie wyraża lucyferazę i przenosi oporność na kanamycynę. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia pozwól, aby bulion Luria (LB) osiągnął temperaturę pokojową (25 °C) w szafce do zabezpieczeń biologicznych.
- Pod maską szafki biosafety zidentyfikuj pojedynczą kolonię z płyty z prążkami i zaszczep ją w 3 mL LB z dodatkiem kanamycyny (30 μg/mL). Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C z potrząsaniami o prędkości 220 obrotów na minutę (rpm). To jest kultura startowa.
- Rozcieńcz hodowlę zaczynową w stosunku 1:100 do świeżej 3 mL LB pod maską szafki biosafety i przestaw ją do inkubatora na 2-3 godziny w temperaturze 37 °C, potrząsając (220 obr./min). To jest kultura stock.
- Odczytaj gęstość optyczną (OD) zarówno pustej płyty, jak i hodowli stockowej przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Dodaj 100 μL LB (bez bakterii) do jednego dołku płytki testowej z płaskim dnem z 96 dołkami; To jest pustka. Następnie dodaj 100 μL z hodowli stockowej do osobnego odwiertu. Powtórz to dla dwóch dodatkowych replik. Absorpcja jest odczytywana za pomocą czytnika płytowego.
- Odejmij absorpcję pustej od wartości absorpcji hodowli stockowej (wartość OD) i porównaj z wcześniej wygenerowaną i zweryfikowaną krzywą wzrostu, aby określić przybliżenie gęstości bakterii w hodowli stockowej do przygotowania dawki zakaźnej.
- Generuj docelową inokulę w zależności od pytania badawczego. W badaniu zastosowano docelowe inokulum o wielkości 2 x 10⁶ (niskie) oraz 7 x 10⁶ (wysokie) jednostek tworzących kolonie (CFU) na mysz (/mysz).
- Podziel docelową dawkę na mysz (DoseT) przez szacowane stężenie bakterii w hodowli stockowej (Stock), aby uzyskać potrzebną ilość bakterii z probówki (VS).
- Pomnóż VS przez liczbę myszy (NM), które trzeba zainfekować, wraz z wystarczającą ilością dla 5-10 dodatkowych, co daje łączną ilość bakterii potrzebnych do infekcji, plus 5-10 dodatkowych dawek. Usuń tę objętość z oryginalnej rurki i dodaj ją do nowej rurki wirówki.
- Użyj poniższego równania: DawkaT/Zapas = VS x NM = całkowita objętość (VT) bakterii do usunięcia z oryginalnej tubki.
- Wiruj bakterie w dawce 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 50 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (pH 7,2-7,6) na mysz do zakażenia (np. dla 10 dawek 2 bakterii o rozmiarze 10⁶ w każdej dawce, granulat 2 bakterii o pojemności 10⁷ zostanie ponownie zawieszony w 500 μL PBS). Ponownie zaleca się przygotowanie większej ilości inokulum niż jest to konieczne. Przygotuj jednakową ilość PBS tylko do szczepień kontrolnych. Utrzymuj zakaźne szczepienie i kontrolę PBS na lodzie aż do zakażenia.
- Wykonaj siedem dziesięciokrotnych serii rozcieńczeń do PBS w 96-dołkowej płytce rozcieńczającej plastikowe dno, a następnie nałóż 25 μL rozcieńczeń w duplikacie na kwadrantowych płytkach TSA uzupełnionych kanamycyną (30 μg/mL), aby wyliczyć rzeczywistą ilość podanych bakterii. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w celu utworzenia kolonii przed enumeracją.
2. Identyfikacja zwierząt
- Ułóż odpowiednią liczbę par hodowlanych, aby mioty mogły być zsynchronizowane dla szczeniąt w odpowiednim wieku. Zmienność wieku ± 1 dzień jest akceptowalna.
- Zidentyfikuj ciężarną samicę myszy C57BL/6 i monitoruj narodziny miotu przed planowanym eksperymentem, aby dokładnie określić wiek.
- Aby odróżnić młode kontrolne od zakażonych 3- lub 4-dniowych młodych, użyj małych, cienko zakończonych nożyczek do tęczówki, aby obciąć końce ogonów tylko u kontrolnych. Zainfekowane młode nie otrzymują obcinania ogona. Przed odcięciem ogona zdezynfekuj skórę wacikiem polanym 70% etanolem. Naciskaj na koniec ogona wacikiem lub gazą w razie potrzeby.
UWAGA: Procedura ta przeprowadza się pod osłoną szafy biosafe. Wystarczy obcięcie ogona o grubości około 1/8 cala. - Aby zidentyfikować młode w grupie kontrolnej i zakażonej, użyj strzykawki insulinowej o pojemności 1 mL z igłą stałą o wymiarach 28 G x 1/2'' do tatuowania ogonów młodych. Przed tatuażem zdezynfekuj skórę wacikiem nasączonym 70% etanolem. Procedura ta przeprowadza się pod osłoną szafy biosafe.
- Aby wytatuować ogon, nałóż tusz zwierzęcy na czubek igły. Następnie ostrożnie unieruchom szczeniaka jedną ręką, z ogona całkowicie odsłoniętym. Delikatnie wkłuj igłę pod skórę, zachowując powierzchowną głębokość, i przesuwaj igłę równolegle do skóry o kilka milimetrów, aż powstanie mały ślad, czyli kropka. Poczekaj kilka sekund, zanim powoli wyjmiesz igłę spod skóry, aby zapobiec uwolnieniu nadmiaru tuszu spod skóry.
- Przykładaj nacisk na ranę wacikiem lub gazą w razie potrzeby. Usuń nadmiar tuszu z powierzchni skóry za pomocą 70% etanolu.
- Powtarzaj ten proces z kolejnymi myszami w grupie zakażonej i kontrolnej, dodając kolejną kropkę przy każdym kolejnym tatuażu szczeniaka (np. szczenię 1 będzie miało jedną kropkę na ogonie, szczenię 2 dwie kropki na ogonie itd.).
UWAGA: Dla dodatkowej warstwy identyfikacji zaleca się stosowanie oddzielnych kolorów tuszu do tatuażu zwierzęcego dla grup kontrolnych i zakażonych.
3. Szczepienie podłopatkowe
UWAGA: W tym badaniu przeprowadzono 2 eksperymenty z grupą przyjmującą niskie i wysokie dawki dla każdego eksperymentu. W pierwszym eksperymencie 7 szczeniąt otrzymało niskodawkową inokulum (4 młode zostały użyte jako kontrola), a 5 szczenięt z osobnego miotu otrzymało wysoką dawkę (3 młode jako kontrolne). Szczenięta z eksperymentu 1 dostarczyły danych tylko dla punktu czasowego 24 godzin. W drugim eksperymencie 8 młodych otrzymało szczepionkę o niskiej dawce (2 młode jako kontrolę), a 6 młodych otrzymało szczepionkę o wysokiej dawce (2 młode jako kontrolne). Pupy z eksperymentu 2 dostarczyły danych dla punktów czasowych 0, 10 i 24 godzin.
- Dopasowanie wieku szczeniąt ≤ 1 dzień. Przypisz każdy miot jako żwirek niskiej lub wysokiej dawki. W miocie losowo przypisz szczenięta do kontroli lub zainfekowanego.
- Trzeciego lub czwartego dnia po porodzie zapisz masę wszystkich młodych przed szczepieniem E. coli-lux lub kontrolą PBS. W tym czasie oddziel matkę od młodych, aby nie zostały przeniesione podczas infekcji.
- W szafce bioasekuracyjnej za pomocą igły insulinowej aspiruj albo PBS, albo inokulum E. coli-lux . Do tych prac użyto inokuli o wymiarach 2 x 10⁶ oraz 7 x 10⁶ CFU na mysz. Trzymaj zarówno zakaźne inokulum, jak i PBS na lodzie do czasu podania przez zastrzyk podłopatkowy.
- Połóż noworodka na czystej powierzchni w okapu szafki biosafety i unieś skórę na karku, jakbyś chciał psa podrapać za kark.
- W przestrzeni utworzonej między skórą a mięśniem zwierzęcia należy włożyć igłę, skosować do góry, tuż pod skórą i wstrzyknąć 50 μL PBS lub E. coli-lux. Jednocześnie uwolnij uciśniętą część skóry, aby zapobiec cofaniu się z zastrzyków.
- Wyjmij igłę powoli i ostrożnie. Po zakończeniu zastrzyków odkładaj szczenięta z zaporami. UWAGA: Ze względu na anatomiczny etap rozwoju, technicznie trudno jest podać noworodkom żyłę ogonową lub zastrzyk wewnątrzotrzewnowy w 3-4 dniu. Dlatego do tego badania wybrano drogę infekcji podłopatkowej ze względu na łatwość przeprowadzenia.
