Wykrywanie bakterii in situ w przekrojach tkanki dziąseł myszy

Źródło: Choi, Y. S. i in. Wykrywanie in situ bakterii w tkankach osadzonych w parafinę za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną, celującej w 16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje in situ wykrywanie bakterii w przekrojach tkanki dziąseł myszy za pomocą sond DNA znakowanych digoksyną skierowanych do DNA bakterii. Sekcja jest inkubowana sondą. Dodaje się przeciwciała sprzężone z fosfatazą alkaliczną, specyficzne dla digoksyny. Endogenne fosfatazy są inaktywowane, a kolorowy wysad uzyskuje się poprzez dodawanie podłoża. Sekcja jest impregnowana kontrastowo, odwodniona, oczyszczana ksylenem i montowana przed mikroskopową wizualizacją bakterii.

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. etyki zwierząt.

1. Przygotowanie sondy

Amplifikacja PCR sondy
1. Dla sondy specyficznej dla Porphyromonas dzęszącej amplifikuj fragment DNA P. gingivalis 16S rRNA o długości 343 bp za pomocą PCR, wykorzystując genomowe DNA P. gingivalis oraz następujące startery: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA AG-3' oraz 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Wykonaj amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 35 cykli w 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 1 min 20 s, a następnie 5 min wydłużenie w 72 °C.
2. Amplifikuj sondę eubakterialną za pomocą fragmentu DNA o masie 70 bp (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTGTCGTCGTGTGGTGAAATGTGTGTGTGTTAAGTCCCGCAACGAGCCAACCC-3') syntezowanego jako oligonukleotyd oraz następujących starterów: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' i 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GTT-3'. Wykonaj amplifikacje w następujących warunkach cyklu: 40 cykli przy 94°C przez 30 s, 60 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 1 min 20 s, a następnie 5-minutowe przedłużenie przy 72 °C.
3. Wytrącaj produkty PCR (≥500 μl), dodając 3 M octana sodu (pH 5,2) i 100% etanolu (w proporcji 10:1:2) i inkubuj w temperaturze -20 °C przez 2 godziny.
4. Wiruj mieszaninę w stężeniu 14 000 x g przez 15 minut, ponownie zawiesij granulat w 100 μl buforu Tris-etylendiaminetetraacetycznego (EDTA) lub TE i mierz stężenie DNA według gęstości optycznej na 260 nm.
Znakowanie digoksygeniny (DIG) za pomocą zestawu do oznakowania i wykrywania DNA DIG
1. Wymieszaj 3 μg sondy z wodą, aby uzyskać końcową objętość 15 μl.
2. Denaturuj DNA w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schłodzić na lodzie.
3. Dodaj 2 μl 10x mieszanki heksanukleotydowej, 2 μl mieszanki znakującej trifosforan deoksynukleozydu (dNTP) oraz 1 μl enzymu Klenowa do 15 μl zdenaturowanego DNA.
4. Wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 do 48 godzin, a reakcję zatrzymaj przez podgrzewanie w 65 °C.
Sprawdź czułość sondy oznaczonej DIG za pomocą zestawu do oznakowania i wykrywania DNA DIG
1. Ręcznie załaduj 1 μl szeregowych rozcieńczeń sondy z dodatnim sterowaniem dostarczonym w zestawie oraz 1 ng sondy oznaczonej DIG na membranę nylonową i susz przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
2. Krótko namocz błonę w 2x buforze soli fizjologicznej i cytrynianu sodu (SSC) (0,3 M chlorku sodu lub NaCl, 30 mM cytrynianu sodu, pH 7,0) i inkubuj błonę w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, aby unieruchomić DNA.
3. Krótko namocz błonę w buforze kwasu maleinowego (MAB, 0,1 M kwasu maleinowego, 0,15 M NaCl, pH 7,5) i inkubuj z przeciwciałem sprzężonym z anty-DIG alkaliczną fosfatazą (AP), rozcieńczonym (1:5 000) w 6 ml roztworu blokującego dostarczonego w zestawie w RT przez 30 minut.
4. Przemyj membranę MABT (MAB zawierający 1% Tween 20) i nałóż 40 μl nitro-niebieskiego tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3'-indolylowego fosforanu (NBT/BCIP) zmieszanego z buforem detekcyjnym 2 ml (0,1 M tris(hydroksymetylo)aminometanu chlorowodorku lub Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M chlorku magnezu lub MgCl₂, pH 9,5) na błonę przez 1 minutę. Jeśli czułość oznaczonej sondy nie jest zadowalająca, powtórz kroki od 1.1.3 do 1.3.4.
5. Zmierz stężenie DNA w znakowanej sondzie (OD₂₆₀) i dostosuj stężenie do 100 ng μl-1.
Sprawdź specyficzność sondy oznaczonej DIG
1. Denaturacja próbek DNA genomowych (25 ng 3 μl-1 na próbkę) różnych gatunków bakterii, w tym tej wybranej przez konkretną sondę, w temperaturze 95 °C przez 10 minut i szybko schłodzić na lodzie.
2. Ręcznie załaduj zdenaturowane DNA na membranę nylonową i susz przez 20 minut w RT.
3. Krótko zanurz błonę w 2x buforze SSC i inkubuj ją w temperaturze 80 °C przez 2 godziny, aby unieruchomić DNA.
4. Blokuj błonę roztworem blokującym na RT przez 1 godzinę.
5. Rozcieńcz sondę w stężeniu 1 ng μl-1 w buforze hybrydyzacyjnej, denaturuj rozcieńczone sondy i nałóż je na błonę.
6. Inkubuj błonę w temperaturze 45 °C przez godzinę.
7. Przemyj membranę trzy razy buforem SSC.
8. Krótko namocz błonę w MAB.
9. Inkubuj przeciwciałem sprzężonym z AP przeciwciałem anty-DIG rozcieńczonym (1:2 000) w 6 ml roztworu blokującego w RT przez 1 godzinę.
10. Przemyj membranę MABT i nałóż 40 μl roztworu NBT/BCIP zmieszanego z buforem detekcyjnym 2 ml.
11. Gdy sonda nie osiągnie oczekiwanej swoistości, zwiększ temperaturę hybrydyzacji aż do zaobserwowania specyficzności.

2. Hybrydyzacja in situ

Uwaga: Aby uniknąć wysychania próbek i odczynników, wszystkie inkubacje wykonuj w nawilżonej komorze wyłożonej mokrymi ręcznikami papierowymi.

Odparafinizacja i nawodnienie przekrojów tkanek
1. Przygotuj przekroje tkanek o grubości 4 μm z bloków osadzonych w parafinie. Formalina, paraformaldehyd i utrwalacz na bazie są kompatybilne z tym protokołem.
2. Przygotuj wszystkie odczynniki przy użyciu wody uzdatnianej dietylopirowęglanem (DEPC).
3. Ciepło przesuwa się w suchym piekarniku w 60 °C przez 30 minut, a zsuwa się inkubuje na RT przez 30 minut.
4. Zanurz w 100% ksylenie przez 5 minut trzy razy; Za każdym razem używaj świeżego ksylenu.
  Uwaga: Wykonaj ten zabieg odwoskowania w okapie chemicznym.
5. Zanurz preparaty w 100% etanolu przez 5 minut dwa razy, za każdym razem używając świeżego etanolu, a próbki nawadniaj w roztworach seryjnych 90%, 80% i 70% etanolu przez 5 minut każdy.
6. Zanurz preparaty w wodzie impregnowanej DEPC na 1 minutę, a preparaty płucz w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym DEPC (pH 7,4) przez 6 minut.
Wstępne zabiegi przekrojów tkanek
1. Zanurz zjeżdżalnie w kwasie solnym 0,1 N na 20 minut, a ślizgawki płukaj w wodzie uzdatnianej DEPC przez 30 sekund.
2. Narysuj hydrofobową barierę otaczającą okazy za pomocą woskowego długopisu.
  Uwaga: Wielkość bariery hydrofobowej zależy od wielkości próbek. Dlatego objętości odczynników używanych w kolejnych etapach różnią się w zależności od wielkości próbek, ale muszą wypełnić barierę hydrofobową (50 μl dla małych próbek i 400 μl dla dużych próbek).
3. Preparaty należy poddawać 50 do 400 μl proteinazy K (1 do 10 μg ^ml-1 w PBS poddawanej DEPC) w suszonym piecu w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a szkiełki płukać w 1x PBS impregnowanym DEPC przez 1 minutę.
4. Mocz szkiełka w 4% paraformaldehydu w PBS impregnowanym DEPC przez 10 minut, a następnie myj szkiełka w PBS impregnowanym DEPC przez 1 minutę.
5. Preparaty moczy się w 0,1 M trietanolaminy-HCl (pH 8,0) zawierającej 0,5% bezwodnika octowego przez 20 minut, a szkiełka można przepłukać w wodzie impregnowanej DEPC przez 30 sekund.
Hybrydyzacja z sondą i płukanie
1. Zanurz slajdy w buforze 2x SSC na 20 minut.
2. Rozcieńcz sondę w stężeniu 1 ng ^μl-1 w buforze hybrydyzacyjnym (4x SSC, 50% [vol/vol] formamidu, 1x roztwór Denhardta, 10% [wt/vol] dextran siarczan, 0,1% [wt/vol] siarczan sodu dodecylowy, 0,4 mg ml-1 DNA plemnika łososia). W przypadku kontroli negatywnej wymieszaj oznakowaną sondę z dziesięciokrotnie większą ilością sondy nieoznakowanej.
3. Denaturuj rozcieńczone sondy i nałóż 50 do 400 μl na przekroje tkanki. Załóż na zasuwkę okładkę i zabezpiecz ją lakierem do paznokci.
4. Preparaty cieplne w maszynie PCR w temperaturze 90 °C przez 10 minut oraz inkubują preparaty w nawilżonej komorze przez noc (O/N) w 45 °C lub optymalnej temperaturze określonej w kroku 1.4.11.
5. Schłodzić zamki w 4 °C przez 30 minut, usunąć pokrywy i zanurzyć je w szeregowym buforze SSC w następujący sposób: 4x SSC przez 10 minut, wcześniej podgrzane (45 °C), 2x SSC przez 20 minut, 2x SSC przez 10 minut i 0,2x SSC przez 10 minut.
Wykrywanie za pomocą przeciwciał sprzężonych z AP anty-DIG
1. Wash slide w MABT przez 5 minut.
2. Blokuj z 50 do 400 μl roztworu blokującego i 1% Tween 20 przez 20 minut.
3. Dodaj od 50 do 400 μl przeciwciał anty-DIG-AP rozcieńczonych w roztworze blokującym (1:1 000) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
4. Wash slide w MABT przez 10 minut.
5. Zanurz slajdy w buforze detekcyjnym zawierającym 1% Tween 20 przez 5 minut.
6. Traktuj 50 do 400 μl 1 mM levamisolu (w buforze wykrywającym zawierający 1% Tween 20) przez 5 minut, aby inaktywować endogenną fosfatazę alkaliczną.
7. Rozprowadz 50 do 400 μl gotowego roztworu NBT/BCIP (rozcieńczonego w buforze detekcyjnym w stosunku 1:100) na każdy preparat i inkubuj szkiełka w nawilżonej komorze na RT przez 2 do 3 godzin, aż sygnał uzyskany będzie zadowalający.
8. Płukaj szkiełki wodą dejonizowaną, aby przerwać wizualizację, i nałóż 50 do 400 μl 0,05% [masa/objętość] zieleni metylowej jako kontrast w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
9. Płucz szkiełka wodą dejonizowaną, susz w 100% etanolu i zanurz w ksylenie.
10. Nałóż 80 μl roztworu montażowego na każdy zamek i okładkę z osłonami pokrywającymi.

Nazwa	Firma	Numer katalogowy
Bezwodnik octowy	Sigma	6404
50% roztwór siarczanu dekstranu	Millipore	S4030
Rozwiązanie 50X Denhardta	Sigma	D2532
Pirowęglan dietylu (DEPC)	Sigma	P159220
Zestaw do znakowania i wykrywania DNA z digoksygeninami (DIG)	Roche	11 093 657 910
Formamid	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Wektor	SP-5000
Chlorek magnezu	Sigma	246964
Kwas maleinowy	Sigma	M0375
Zieleń metylowa	Sigma	M6776
Paraformaldehyd	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Roztwór DNA plemnika łososia	Invitrogen	#15632-011
Chlorek sodu	Sigma	S9625
Cytrynian sodu	Duksan	D1420
Siarczan sodu dodecylowy	Amresco	227
Trietanolamina-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Organizmy badawcze	3098T

Wykrywanie bakterii in situ w przekrojach tkanki dziąseł myszy

W tym artykule

Streszczenie

Protokół

Materiały

Tagi