Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (GIMM)

Podsumowanie

Ocena motoryki okrężnicy w dystalnej części jelita grubego świnki morskiej przy użyciu monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor – GIMM) jest prostym i łatwym do opanowania podejściem do ilościowej oceny motoryki propulsywnej w przewodzie pokarmowym.

Streszczenie

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor, GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) to system in vitro służący do monitorowania motoryki napędowej w izolowanych odcinkach końcowej części okrężnicy świnki morskiej. Kompletny system składa się z komputera, kamery wideo, oświetlonej kąpieli organowej, pomp cyrkulacyjnych do kąpieli wodnej (perystaltycznej i podgrzewanej) oraz dedykowanego oprogramowania GIMM do rejestracji i analizy danych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami monitorowania perystaltyki okrężnicy, system GIMM umożliwia ciągłą, ilościową ocenę motoryki. Końcowy odcinek okrężnicy świnki morskiej jest zanurzony w ogrzanym i natlenionym roztworze Krebsa, a wprowadzone do końca proksymalnego grudki kału są przesuwane wzdłuż odcinka okrężnicy z prędkością około 2 mm/sec. Nagrywane są filmy przedstawiające przemieszczanie się grudki kału wzdłuż odcinka, a oprogramowanie GIMM pozwala na śledzenie postępu tej grudki. Prędkości motoryki napędowej można uzyskać dla całego odcinka lub dla dowolnego wybranego obszaru. Oprócz analizy wzorców motoryki indukowanej przejściem treści (bolusa), z przechwyconych segmentów wideo można stworzyć mapy czasoprzestrzenne w celu oceny wzorców spontanicznej aktywności motorycznej. Zastosowania tego systemu obejmują farmakologiczną ocenę wpływu agonistów i antagonistów receptorowych na motorykę napędową, a także ocenę zmian wynikających ze stanów patofizjologicznych, takich jak stan zapalny czy stres. Test motoryki napędowej końcowej części okrężnicy świnki morskiej z wykorzystaniem systemu GIMM jest przejrzysty i łatwy do opanowania, zapewniając niezawodną i powtarzalną metodę oceny motoryki napędowej.

Protokół

1. Przygotowanie tkanki jelita grubego do GIMM

1. Aby przygotować segment końcowej części okrężnicy do monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor, GIMM), należy najpierw umieścić wyizolowaną okrężnicę w lodowatym roztworze Krebsa (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1,2 mM MgCl2₂, 25 mM NaHCO₃₃, 1,2 mM NaH₂PO₄oraz 8 mM glukozy; napowietrzane 95% O2₂/5% CO₂). Usuń pozostałości krezki z zewnętrznej ściany i wykonaj niewielkie nacięcie na końcu jamnym, aby umożliwić jego rozróżnienie po umieszczeniu w kąpieli organowej. Uwaga: tkankę można przechowywać w schłodzonym roztworze Krebsa do 2 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Następnie należy umieścić przewody dopływowe i odpływowe w kąpieli organowej w taki sposób, aby znajdowały się one poza polem widzenia kamery, co zapobiegnie zakłóceniom podczas akwizycji obrazu. Kąpiel organową należy stale perfundować podgrzanym wcześniej (37°C) natleniony (95% O2, 5% CO2)₂) roztwór Krebsta z szybkością przepływu 10 ml/min.
3. Zachowując orientację końca oralnego i analnego, przypnij segment okrężnicy dystalnej (co najmniej 5 cm) za oba końce w kąpieli organowej, pozostawiając niewielki luz, aby segment mógł swobodnie przesuwać się do 1 cm w środkowej części. Koniec oralny powinien być skierowany w stronę badacza, aby ułatwić umieszczenie granulatu kałowego. Segmenty okrężnicy powinny być przypinane w ten sam sposób przez tego samego badacza w każdym doświadczeniu w ramach danego zestawu badań, ponieważ długość i napięcie segmentu wpływają na tempo motoryki propulsyjnej, a rozciągnięcie wzdłużne zmniejsza szybkość pasażu (Dickson i wsp., 2007).
4. Pozostawić preparat do wyrównania potencjałów przez co najmniej 30 min.

2. Konfiguracja GIMM i akwizycja danych

1. W systemie GIMM odcinek okrężnicy w komorze perfuzyjnej jest oświetlany od dołu. Nad komorą umieszczono cyfrową kamerę wideo połączoną z komputerem. Należy upewnić się, że zarówno źródło światła, jak i oprogramowanie GIMM są włączone.
2. Po skonfigurowaniu nowego eksperymentu w aplikacji oprogramowania GIMM, należy rozpocząć pierwszą próbę, wprowadzając powlekaną epoksydą kałową grudkę do ustnego końca odcinka okrężnicy, aby zainicjować perystaltykę. Kliknij przełącznik kamery w komputerze, aby ją uruchomić, a następnie kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć rejestrację. Ruch grudki w kierunku odbywkowym jest rejestrowany przez kamerę wideo, a cyfrowe nagrania są zapisywane na komputerze PC do późniejszej analizy. Gdy grudka dotrze do końca odcinka okrężnicy, kliknij przycisk nagrywania, aby zatrzymać rejestrację.
3. Aby uzyskać wartość kontrolną prędkości przesuwania, należy rozpocząć od odcinka okrężnicy pochodzącej od zdrowego zwierzęcia, bez podawania leków. Przeprowadź 3-5 prób na pojedynczym preparacie, z 5 min przerwą na regenerację między kolejnymi uruchomieniami.
4. Aby określić wpływ określonych warunków lub leków na motorykę okrężnicy, wykonaj 3-5 prób/preparatu dla każdego warunku eksperymentalnego. Ponadto każdy eksperyment należy przeprowadzić na co najmniej pięciu różnych okrężnicach pochodzących od co najmniej pięciu różnych zwierząt.
5. Podczas analizy cyfrowych nagrań prędkość przesuwania grudki kałowej oblicza się jako czas, w jakim grudka pokona X cm odcinka okrężnicy.

3. Konstrukcja map czasoprzestrzennych

1. Cyfrowe nagrania wideo pozyskane z poszczególnych serii pomiarów GIMM mogą zostać przekształcone w mapy czasoprzestrzenne przy użyciu dedykowanego oprogramowania GIMM.
2. Na osi poziomej zmiany średnicy jelita grubego są naniesione w funkcji czasu poprzez przekształcenie obrazu jelita z każdej klatki wideo w sylwetkę, a następnie obliczenie i konwersję średnicy wzdłuż całej długości na skalę szarości. W rezultacie pellet oraz obszary relaksacji są widoczne jako czarne, natomiast obszary skurczu jako białe.
3. Odległość, jaką pellet przebył przez segment jelita grubego, jest reprezentowana na osi pionowej.

4. Reprezentatywne mapy spacjoczasowe

1. Przedstawione tutaj reprezentatywne mapy czasoprzestrzenne ukazują motywność treści jelitowych w segmentach okrężnicy w różnych warunkach doświadczalnych. Oś y (pionowa) reprezentuje pozycję treści w czasie, natomiast oś x (pozioma) reprezentuje odległość, jaką treści przebyły przez segment okrężnicy.
   
   
   
2. Na mapie czasoprzestrzennej z kontrolnej okrężnicy (nieleczonej, prawidłowej) treści przemieszczają się liniowo z prędkością ~2 mm/sec. W przeciwieństwie do tego, podanie niektórych leków lub stan zapalny okrężnicy może prowadzić do zaburzeń wzorców motywności, takich jak motywność zatrzymana lub niedrożność motywności.
3. Wyniki z GIMM mogą być również przedstawione w formie wykresów, w których oś y reprezentuje odległość w milimetrach przebytą przez treści kałowe, a oś x reprezentuje czas w sekundach. Na przykład podanie DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), agonisty receptorów opiatowych μ, powoduje spadek motywności napędowej w okrężnicy.

Dyskusja

Nerwowo zależna motoryka propulsyjna w przewodzie pokarmowym została po raz pierwszy opisana ponad wiek temu przez Baylissa i Starlinga (Bayliss and Starling, 1899). Obserwacja ta doprowadziła do zdefiniowania nerwów jelit jako enterycznego układu nerwowego (ENS), który stanowi odrębną część autonomicznego układu nerwowego (Langley, 1921). Neurogenna perystaltyka jelitowa obejmuje rozciąganie i/lub stymulację śluzówki w danym punkcie, co wywołuje odruchowe skurcze powyżej (w kierunku ustnym) poziomu bodźca oraz rozkurcz w kierunku odbytowym. Wynikiem tego procesu jest wytworzenie gradientu ciśnienia, który przesuwa zawartość światła jelita w kierunku od ust do odbytu. W jelicie cienkim wielu gatunków oraz w jelicie grubym szczura fale skurczów perystaltycznych mogą być aktywowane poprzez infuzję płynu do światła segmentów jelita. W dystalnej części okrężnicy świnki morskiej do końca ustnego okrężnicy można wprowadzić naturalne lub sztuczne pellety kałowe, a następnie łatwo monitorować ich przemieszczanie się wzdłuż segmentu jelita. W związku z tym dystalna część okrężnicy świnki morskiej stanowi prosty i użyteczny model do badania motoryki propulsyjnej w jelitach.

Perystaltyka jest złożonym odruchem nerwowym, w który zaangażowanych jest szereg związków neuroaktywnych i receptorów. W związku z tym związki wpływające na neurotransmisję w ENS wpływają na szybkość motoryki napędowej. Serotonina, uwalniana głównie z komórek enterochromafilnych w błonie śluzowej jelita, uczestniczy w inicjowaniu odruchu perystaltycznego. Wykorzystując końcowy odcinek okrężnicy świnki morskiej, Grider i współpracownicy wykazali, że motoryka napędowa jest wzmacniana przez podanie do światła jelita agonistów receptora 5-HT₄ (Foxx-Orenstein et al., 1998; Grider et al., 1998), podczas gdy aplikacja do kąpieli antagonistów receptorów 5-HT₃ i 5-HT₄ zmniejsza szybkość przesuwania treści (Kadowaki et al., 1996; Linden et al., 2003b). Ponadto hamowanie transportera serotoniny za pomocą selektywnych inhibitorów zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI) zwiększa perystaltykę przy niskich stężeniach, natomiast zmniejsza ją przy wyższych stężeniach, co prawdopodobnie wynika z desensytyzacji receptorów 5-HT (Kadowaki et al., 1996; Wade et al., 1996). Innymi cząsteczkami sygnałowymi przyczyniającymi się do motoryki napędowej u świnki morskiej jest acetylocholina działająca na receptory nikotynowe, która jest głównym mediatorem przekazywania sygnałów międzyneuronalnych w jelitach. Blokowanie transmisji synaptycznej za pomocą heksametonium, antagonisty receptorów nikotynowych, zmniejsza przesuwanie treścika przy wysokich stężeniach, podczas gdy niższe stężenia nie wpływają na szybkość przesuwania (Kadowaki et al., 1996). Opiaty oraz agoniści receptorów opioidowych, o których od dawna wiadomo, że działają hamująco na motorykę przewodu pokarmowego, zmniejszają przesuwanie treścika w modelu motoryki napędowej świnki morskiej (Foxx-Orenstein et al., 1998; Wood et al., 2009). Co ciekawe, daikenchuto, tradycyjny japoński lek ziołowy stosowany klinicznie w leczeniu wymiotów, bólów brzucha i zaburzeń motoryki, zmniejsza szybkość przesuwania treścika po podaniu wraz z naloksonem (antagonistą opioidów), a podany samodzielnie powoduje perystaltykę wsteczną (Wood et al., 2009). Wyniki te ilustrują użyteczność modelu motoryki napędowej świnki morskiej w ocenie wpływu różnych związków i ich receptorów na wzorce motoryki okrężnicy.

Liczne badania wykazały, że stan zapalny prowadzi do zmian w właściwościach elektrycznych i synaptycznych neuronów okrężnicy (Linden et al., 2003a; Lomax et al., 2005), a zmiany te mogą utrzymywać się przez wiele tygodni po ustąpieniu stanu zapalnego (Krauter et al., 2007; Lomax et al., 2007). Wpływ zmian neuroplastycznych indukowanych przez colitis na motorykę propulsyjną można badać w dystalnej części okrężnicy świnki morskiej przy użyciu systemu GIMM. System ten posiada kilka zalet w porównaniu z tradycyjną metodą monitorowania motoryki okrężnicy, która ocenia motorykę propulsyjną poprzez proste pomiar czasu, w jakim pellet kałowy pokonuje daną odległość. Wcześniejsze badania nad indukowaną stanem zapalnym plastycznością neuronalną w okrężnicy wskazały na spadek prędkości transportu pelletów (Linden et al., 2003a; Linden et al., 2005), jednak nowsze badania z wykorzystaniem systemu GIMM ujawniły bardziej złożone zmiany (Strong et al., 2010). Na przykład tempo transportu pelletów jest zmniejszone w obszarach owrzodzenia w zapalnej dystalnej części okrężnicy, podczas gdy motoryka jest przyspieszona w obszarach sąsiednich – zjawisko to nie zostało rozpoznane przy użyciu wcześniejszej metody „stoperowej”. Inne badania wykazały, że dysmotoryka w aktywnej fazie stanu zapalnego może zostać cofnięta poprzez hamowanie COX-2 (Linden et al., 2004), jednak zmieniona motoryka, która utrzymuje się po ustąpieniu stanu zapalnego, jest niewrażliwa na COX-2 (Krauter et al., 2007). Co więcej, w tych późniejszych badaniach mapy czasowo-przestrzenne generowane przez system GIMM ujawniły schodkowy wzorzec motoryki okrężnicy obserwowany u zwierząt po zapaleniu, co przyczynia się do obniżenia tempa transportu.

Podsumowując, test napędowej motoryki dystalnego odcinka okrężnicy świnki morskiej stanowi wysokoprzepustową metodę pomiaru wpływu badanych związków i stanów patologicznych na motorykę okrężnicy. Ponadto system GIMM zapewnia prostą i przejrzystą metodę oceny napędowej motoryki okrężnicy in vitro. Umożliwia on ciągłe pomiary przesuwania się treści jelitowej (pelletów), a także generowanie map czasoprzestrzennych w celu badania wzorców aktywności spontanicznej. W porównaniu z tradycyjnymi metodami pozwala on również na uchwycenie bardziej złożonych zjawisk, które mogą być ilościowo określone i analizowane na wiele sposobów, ponieważ pliki cyfrowe są zapisywane w systemie i pozostają łatwo dostępne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór Krebsa’
Izofluran	Znieczulenie	Webster Veterinary
Kuleczka kałowa powlekana epoksydem				naturalna kuleczka kałowa świnki morskiej, wysuszona i powlekana epoksydem (czarny lakier do paznokci)
Pęseta		Fine Science Tools
Mikronóżki		Fine Science Tools
Szpile ze stali nierdzewnej
Zlewki				500 mL
Butla z gazem				95% O2/5% CO2
Stoper
Monitor motoryki przewodu pokarmowego		Catamount Research and Development		http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm