$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
Wizualizacja zakażenia za pomocą bioluminescencji
- Aby zobrazować postęp infekcji, należy wprowadzić chromosomalny bioluminescencyjny operon (luxCDABE) do testowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa PGN5 i VE2. Plazmidy i protokół stosowany do oznaczania tych szczepów zostały opracowane w laboratorium Schweizera i mogą nie być kompatybilne ze wszystkimi gatunkami/szczepami bakterii. Co ważne, wizualizacja infekcji jest opcjonalna; dlatego do przeprowadzenia badania śmiertelności nie jest konieczne genomowe wprowadzenie tego operonu.
- Przygotuj i zaakceptuj szczepy. Dodatkowo na każdym etapie walidacji sprawdź bioluminescencję w szczepach znakowanych.
- Po przygotowaniu szczepów wstrzykuj zwierzętom w grupach po 10, a bioluminescencyjne szczepy zgodnie z powyższymi krokami.
- Obrazuj zwierzęta co 3 godziny przez 24 godziny, używając systemu obrazowania zwierząt zdolnego do bioluminescencji.
- Najpierw przygotuj obraz, ustawiając parametry kamery i podgrzewając scenę dla zwierząt. Następnie ustaw przepływ tlenu na 1,5 L na minutę (lub postępuj zgodnie z zaleceniami producenta).
- Po ustabilizowaniu obrazowania i etapu należy umieścić jedną mysz w komorze znieczulonej zaraz po wstrzyknięciu i podać 3,5% izofluranu do komory z przepływemO2 przez około 4 minuty. Metody znieczulenia mogą się różnić w zależności od komory i/lub środka znieczulającego; Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta. Określ właściwą znieczulenie za pomocą testu odruchu odstawienia.
- Przenieś mysz na etap stabilizacji temperatury. Ustaw mysz na plecach z wyciągniętymi ramionami i przygotuj jej stożek nosowy do podawania 2,5% izofluranu przez cały proces obrazowania.
- Zamknij drzwi i zrób bioluminescencyjne zdjęcia oraz zdjęcia rentgenowskie myszy.
- Po zakończeniu obrazowania wróć mysz do klatki i monitoruj ją. Mysz powinna odzyskać przytomność w ciągu 3-5 minut.
- Kontynuuj obrazowanie myszy co 3 godziny przez 24 godziny, za każdym razem używając innej myszy z każdej grupy. Nie rób ponownego obrazowania myszy w ciągu 24 godzin ze względu na możliwość wystąpienia skutków niepożądanych po ponownym narażeniu na znieczulenie. Jedna mysz powinna otrzymywać tylko jedną dawkę znieczulenia co 24-36 godzin. Wyczyść platformę obrazującą po każdym naświetleniu myszy. Wyłącz obrazowanie między punktami czasowymi obrazowania.
UWAGA: Bioluminescencja zanika, niezależnie od szczepu. Intensywność i długość życia bioluminescencji będą się różnić w zależności od wielu czynników, w tym liczby wstrzykniętych bakterii, szczepu myszy, szczepu bakterii itd.