Wizualizacja infekcji dróg moczowych w modelu myszy z wykorzystaniem bioluminescencji

Streszczenie

Źródło: Luyts, N. i inni. Podłużna kontrola infekcji dróg moczowych i ich leczenia u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencji. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film pokazuje indukcję i śledzenie infekcji dróg moczowych w modelu mysim z wykorzystaniem bioluminescencyjnego E. coli wstrzykniętego do pęcherza, gdzie zachodzi adhezja, inwazja i replikacja wewnątrzkomórkowa bakterii. Światło emitowane z bioluminescencyjnego operonu służy jako wskaźnik w czasie rzeczywistym obciążenia bakteryjnego podczas postępu infekcji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Szczepienie zwierząt

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Wybierz pożądany szczep myszy w zależności od pytania badawczego oraz dostępności linii nokautujących, szczegółów eksperymentalnych oraz różnic w podatności na zakażenia dróg moczowych. Pamiętaj, że cewnikowanie przezuretralne jest łatwiejsze u samic myszy. Nie używaj zwierząt poniżej 8 tygodnia, ponieważ są immunologicznie niedojrzałe. Tutaj użyto 12-tygodniowych samic myszy C57Bl/6J.
   2. Zamawiaj zwierzęta z dużym wyprzedzeniem i pozwól im się zaaklimatyzować, najlepiej przez 7 dni. Grupy trzymają zwierzęta w indywidualnie wentylowanych klatkach, w standardowych 12-godzinnych warunkach światła/ciemności.
   3. Ogol okolice brzucha zwierząt, aby ograniczyć utratę sygnału. Nie używaj kremu do depilacji, ponieważ może on szybko poparzyć skórę zwierząt. Unieruchom zwierzę, mocno trzymając kark i tylne kończyny niedominującą ręką, podczas gdy gol się dominującą ręką. Alternatywnie, gol się pod znieczuleniem izofluranowym.
      UWAGA: Zwierzęta były golone 2 dni przed badaniem obrazowym, biorąc pod uwagę, że jeszcze bardziej zabiegają o ogolony obszar.
   4. Dostarczaj wodę i standardowe jedzenie ad libitum przez cały eksperyment. Jednak należy pozbawiać zwierzęta wody 2 godziny przed instylacją, aby zminimalizować objętość pęcherza podczas instylacji.
   5. Zamontuj sterylną końcówkę angiocewnika 24 g na strzykawkę 100 μL i napełnij ją roztworem bakteryjnym.
      UWAGA: Aby określić luminescencję tła, należy uzyskać obraz bazowy przed instylacją (patrz krok 2 poniżej).
2. Infiltracja zwierząt
   1. Umieść zwierzęta w komorze indukacyjnej i znieczulaj, wdychając izofluran z czystym tlenem jako gazem nośnym (indukcja 3% i utrzymanie 1,5%).
   2. Umieść jedno zwierzę na powierzchni roboczej w pozycji leżącej i utrzymuj stabilną znieczulenie izofluranowe, używając stożka nosowego podczas instylacji. Nałóż maść do oczu.
   3. Wydalaj resztki moczu poprzez delikatny ucisk i ruchy okrężne w okolicy nałonowej. Przed instylacją oczyść dolną część brzucha 70% etanolem.
   4. Nawilż końcówkę cewnika zwykłą solą fizjologiczną. Połóż palec wskazujący niedominującej ręki na brzuchu i delikatnie popchnij go do góry. Rozpocznij cewnikowanie cewki moczowej pod kątem 90° (pionowo), a gdy napotkasz opór, przechyl ją poziomo przed wprowadzeniem dalej (0,5 cm).
      UWAGA: Nigdy nie naciskaj cewnika na siłę, bo to uszkodzi cewkę moczową. Delikatne ruchy obracające mogą być pomocne przy zakładaniu cewnika. Z drugiej strony, brak oporu zwykle wskazuje na błędne wprowadzenie do pochwy.
   5. Wykonaj powolną instylację (5 μL/s) 50 μL inokulum bakteryjnego (2 x 10^{7 CFU} ).
      UWAGA: Wyższe ilości lub szybsza instylacja mogą powodować refluks nerek. Podczas wykonywania tej techniki można użyć niebieskiego tuszu do oceny refluksu.
   6. Po instylacji trzymaj strzykawkę i cewnik na miejscu jeszcze przez kilka sekund, a następnie powoli cofnij, aby zapobiec wyciekowi. Dokumentuj wszelkie nieprawidłowości, takie jak duża ilość przecieku czy krwawy przewód przejściowy, i wykluczaj zwierzęta, jeśli to konieczne.
   7. Ustaw zwierzę w pozycji leżącej na stożku nosa komory obrazującej i powtórz powyższe kroki 1.1.1-1.1.6 dla wszystkich pozostałych zwierząt. Używaj jednego cewnika na każdą grupę eksperymentalną. Upewnij się, że znieczulenie jest kontynuowane i minimalizuj czas między pierwszym a ostatnim zwierzęciem.
   8. W razie potrzeby podaj antybiotyki lub eksperymentalne leki przed lub po badaniu obrazowym (krok 2). Na przykład, aby podać enrofloksacynę, należy dodać 40 μL roztworu enrofloksaciny (100 mg/mL) do 3,96 mL soli fizjologicznej, aby uzyskać rozcieńczenie 1/100. Wstrzyknięcie 100 μL/10 g podskórnie o 9:00 i 17:00, aby podawać 10 mg/kg enrofloksacyny dwa razy dziennie przez 3 dni.

2. Obrazowanie bioluminescencji

1. Przygotowanie i wybór parametrów obrazowania
   1. Otwórz oprogramowanie do akwizycji BLI (patrz Tabela materiałów) i kliknij Inicjalizuj w urządzeniu obrazującym (patrz Tabela materiałów), aby przetestować system sterowania kamerą i sceną oraz schłodzić kamerę CCD do -90 °C.
      UWAGA: W trakcie tego procesu drzwi są zamykane, a postęp inicjalizacji można śledzić na panelu sterowania. Zielone światło oznacza, że osiągnięto temperaturę -90 °C. Ostrzeżenie pojawi się, jeśli przed zakończeniem inicjalizacji zostanie wykonane obrazowanie.
   2. Upewnij się, że dane są zapisywane automatycznie: kliknij na automatyczne zapisywanie akwizycji i wybierz właściwy folder.
   3. Wybierz Luminescencję i Fotografuj. Sprawdź domyślne ustawienia luminescencji: Ustaw filtr wzbudzenia na Block, a filtr emisji na Open.
   4. Ustaw czas naświetlania na Auto przy robieniu pierwszego zdjęcia, zwłaszcza gdy spodziewasz się słabego sygnału, aby zapewnić odpowiednią liczbę fotonów. Dla pomiarów in vivo i jasnych sygnałów ustaw czas naświetlania na ~30 s. Jeśli obraz jest nasycony, pojawi się ostrzeżenie. Jeśli tak się stanie, zmniejsz czas naświetlania.
   5. Wybierz średni Binning, F/stop 1 i wybierz właściwe pole widzenia (FOV) (D dla 5 zwierząt).
   6. Ustaw wysokość obiektu na 1 cm podczas obrazowania myszy.
   7. Kliknij Dodaj trzy razy w Panelu Kontroli Akwizycji, aby uzyskać sekwencję trzech obrazów jako techniczne repliki.
2. Obrazowanie
   1. Umieść myszy w komorze obrazowej w pozycji leżącej i użyj stożka nosa rozmaitościowego do utrzymania znieczulenia (izofluran 1,5%) przez cały eksperyment. Obrazuj do 5 myszy jednocześnie i rozdziel zwierzęta za pomocą przegrody świetlnej, aby zapobiec odbiciom.
   2. Zamknij drzwi i kliknij Przejmuj, aby rozpocząć sekwencję obrazowania.
   3. Wypełnij szczegółowe informacje o eksperymencie (zwierzęta typu dzikiego i nokautowego, zabiegi, dzień badania obrazowego itd.). Ustawienia obrazowania, takie jak czas naświetlania, są zapisywane automatycznie.
   4. Wyjmij myszy z komory obrazowania i odłóż je do klatki. Sprawdź pełną rekonwalescencję po znieczuleniu. W ciągu kilku minut zwierzęta powinny być całkowicie przytomne i pełne eksploracji. Nie podawaj analgezji, ponieważ może to zakłócić przebieg UTI.
   5. Zwróć klatki do wentylowanych regałów do następnego cyklu obrazowania. Po zakończeniu eksperymentu należy uśpić zwierzęta przez uduszenie_CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy. Zrób to przed powrotem do znieczulenia izofluranowego, aby zminimalizować dolegliwość

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paporyzator znieczulony	Harvard Apparatus Limited	Nie ma	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	Nie ma	Enrofloksacyna
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Żółty angiocewnik, użyj sterylnej plastikowej końcówki do instylacji
Myszy C57Bl/6J	Janvier	Nie ma
Wirówka 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Nieokiełznane Laboratoria	Trinejskie	aby zmierzyć OD 600 nm
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanol 70% denaturowany 5L	VWR International	85825360
Falcon 14ml z okrągłym dnem z polistyrenu, zatrzaskową kapsułką	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Strzykawka Hamilton GASTIGHT, zamek luer lock PTFE, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	aby zapewnić powolną instytucję bakterii 50 μL
Pętla inokulacji	Roth	6174.1	holder: Art. Nr 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Produkty weterynarii Dechra	Nie ma	Izofluran
System obrazowania IVIS Spectrum in vivo	PerkinElmer	REF 124262	Urządzenie obrazujące