Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Abstract

Źródło: O'Brien, V. P., i in., Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana ekspozycją pęcherza pochwowego Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz–patogen w nabłonku pęcherza moczowego modelu myszy przed zakażeniem.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały przeanalizowane przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Obrazowanie pęcherzy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

   UWAGA: Procedurę tę można wykonać w dowolnym momencie, gdy pożądana jest wizualizacja urotelu. Jak pokazano na Rysunku 1 (fioletowe ramki), uropatogeniczne interakcje E. coli (UPEC) z urotelem najlepiej wizualizować między 6 a 24 godzinami po szczepieniu UPEC podczas fazy tworzenia rezerwuaru, a złuszczanie urotelialne wywołane przez Gardnerella wagalis najlepiej zobrazować między 3 a 12 godzinami po drugim naświetleniu G. vaginalis .

   1. Utrwalanie pęcherza in situ
      1. Przygotuj utrwalacz bezpośrednio przed pobraniem pęcherza, dodając glutaraldehyd (2,5% final) i paraformaldehyd (2% final) w buforze kakodylatanu sodu o pojemności 0,15 M z 2 mM CaCl2_{przy pH} 7,4. Używaj paraformaldehydu i glutaraldehydu z nowo otwartych szklanych ampulek, ponieważ oba utrwalacze utleniają się z czasem w otwartych pojemnikach. UWAGA: Glutaraldehyd jest toksyczny, drażniący i; paraformaldehyd jest łatwopalny, rakotwórczy, drażniący i toksyną rozrodczą; Kakodylan sodu jest toksyczny i rakotwórczy.
      2. Aby uzyskać 50 ml roztworu utrwalającego, dodaj 6,25 mL 16% paraformaldehydu, 2 mL 50% glutaraldehydu oraz 16,75 mL wody ultraczystej do 25 ml roztworu 0,3 M kakodylanianu sodu o pH 7,4 i 4 mM CaCl₂.
      3. Podgrzej przygotowany utrwalacz do 37 °C przed podaniem do pęcherza.
      4. Napełnij strzykawkę z gruźlicyną z końcówką utrwalającą i przymocuj cewnik na końcu, skosując w kierunku przeciwległym oznaczeniam strzykawki. Odetnij nadmiar rurki na odległość 1-2 mm od końca igły, uważając, by nie odsłaniać czubka igły. Przetrzasz strzykawką, aby usunąć pęcherzyki, a następnie naciśnij tłok, aby opróżnić powietrze, a cewnik napełnić utrwalaczem nad rurką mikrowirówki, aby zebrać utrwalacz i właściwie się utylizować.
      5. Znieczulać i ofiarować mysz zatwierdzoną metodą (np. zwichnięcie szyjki w znieczuleniu). Połóż mysz na powierzchni rozcinania, trzymając nogi zabezpieczone (gumkami lub szpilkami). Otwórz okolicę miednicy myszy za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić pęcherz. Ostrożnie odsuń tłuszcz z sąsiedniego środka, ale pęcherz zostaw na miejscu.
      6. Trzymaj strzykawkę dominującą ręką, z igłą skierowaną w dół, a igła i oznaczenia strzykawki skierowane są tyłem. Zanurz końcówkę cewnika w sterylnym lubrykantze.
      7. Umieść końcówkę cewnika przy otworze cewki moczowej, trzymając korpus strzykawki pod kątem 30-45° nad korpusem myszy.
      8. Nacisk w dół wykonuj bardzo mały ruch zgodnie z ruchem wskazówek zegara końcówką i delikatnie wprowadzaj cewnik do cewki moczowej. Gdy końcówka cewnika wchodzi do cewki, skieruj strzykawkę w stronę ogona myszy, jednocześnie przesuwając cewnik głębiej w cewkę, aż lufa strzykawki będzie równoległa do powierzchni roboczej. Cały trzon igły cewnika (nie licząc podstawy) powinien wchodzić do myszy, umieszczając końcówkę cewnika w świetle pęcherza.
      9. Powoli podawaj 50-80 μL utrwalacza, powodując napompowanie pęcherza jak balon. Trzymaj cewnik na miejscu i lekko podnieś strzykawkę, unosząc końcówkę do góry.
      10. Drugą ręką otwórz hemostat i wsuń jeden kolc pod igłę cewnika w miejscu przecięcia cewki. Częściowo zamknij hemostat, aż tylko dotknie igły.
      11. Delikatnie wyciągnij igłę cewnika z pęcherza, jednocześnie zaciskając i blokując hemostat, aby zapobiec utracie utrwalacza.
      12. Chwyć hemostat tak, aby był równoległy do powierzchni roboczej, z pęcherzem spoczywającym na górze. Podnieś delikatnie i ostrożnie przetnij pod hemostatem (po przeciwnej stronie pęcherza), aby usunąć pęcherz z hemostatem nadal przymocowanym.
      13. Włóż pęcherz i podłączony hemostat do rurki Falcon zawierającej podgrzany utrwalający środek. Upewnij się, że pęcherz jest całkowicie zanurzony w płynie i nie jest przyciśnięty do ścian rurki. Wysiabuj w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
   2. Przetwarzanie pęcherza i obrazowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)
      1. Strzałowo przecinam pęcherz na pół za pomocą czystej, dwustronnej żyletki i wykonuj drugie cięcie styczne do hemostatu, aby uwolnić pęcherz. Daje to 2 półpęcherzowe "kubki". Jeśli na zewnątrz pęcherza są pozostałe poduszki tłuszczowe, delikatnie je usuń.
      2. Przepłucz połówki pęcherza trzy razy (po 10 minut każda) w buforze sodu kakodylatianowym (0,15 M, pH 7,4).
      3. Barw tkankę 1% czterotlenkiem osmu w buforze kakodylatowym 0,15 M przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Osm jest czuły na światło; Dlatego wykonuj ten krok z naczyniem barwiącym owiniętym folią, aby utrzymać ciemne otoczenie. ​
         UWAGA: Czterotlenek osmu jest toksyczny i dla skóry. Wykonaj ten krok w okapu wyparowującym w rękawiczkach.
      4. Przepłukaj połówki pęcherza trzy razy (po 10 minut) w ultraczystej wodzie. Podczas tych etapów na powierzchni wody czasem można zobaczyć osiemowany olej. Aspiruj lub wyczyszczaj, aby zapobiec zanieczyszczeniu podczas suszenia.
      5. Tkanki odwodnić przez zanurzenie w serii ethanolu o stopniu (50, 70, 90, 100 i 100%) przez 10 minut każda.
      6. Susz ustaloną tkankę za pomocą suszarki krytycznej, wykonując 12 wymian_CO2 przy najwolniejszej prędkości. Ustaw wszystkie dodatkowe ustawienia na wolne, z wyjątkiem etapu wentylacji, który jest ustawiony na szybko.
      7. Przeciąć każdy pęcherz na pół czystą, dwustronną maszynką, aby uzyskać łącznie 4 fragmenty, zmniejszyć krzywiznę próbki dla bardziej efektywnej powłoki, ułatwić obrazowanie w SEM oraz odsłonić tkanki, które mogły się zwinąć podczas suszenia.
      8. Przyklej elementy pęcherza do przewodzącej taśmy klejowej na aluminiowym okładce i nałóż niewielką ilość srebrnego kleju wokół dolnej części kontaktu z wykałaczką, uważając, aby nadmiar kleju nie przedostawał się na wewnętrzną powierzchnię pęcherza.
      9. Użyj preparatu do powłaczania sputter coater, aby pokryć odcinki próbki 6 nm irydu. Jeśli próbki nadal się ładują, upewnij się, że przewodząca ścieżka jest namalowana na powierzchnię srebrną farbą i nałóż dodatkowe 4 nm irydu.
      10. Obrazuj próbki mikroskopem skaningowym elektronowym. Chociaż warunki mogą się różnić w zależności od używanego mikroskopu, napięcie przyspieszające 3 KeV przy prądzie wiązki 200 pA i zasięgu roboczym 12-13 mm dobrze działało na Zeiss Merlin FE-SEM przy użyciu detektora elektronów Everharta-Thornleya (SE2).

Results

Rysunek 1. Schemat modelu myszy. Harmonogram jest podkreślony, aby odzwierciedlać fazy lub procedury modelu opisane w protokole. Faza 1 (pomarańczowa): Tworzenie wewnątrzkomórkowych uropatogennych rezerwuarów E. coli (UPEC). Myszy są...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 igły	BD	305106	Dla cewników
5 1/2" prosty hemostat z kleszczem	McKesson	487377	Utrwalanie pęcherza in situ
ACE 600 Powlak Rozterkujący	Leica		Przetwarzanie próbek SEM
Aluminiowy SEM stub	Ted Pella	16111	Przetwarzanie próbek SEM
Chlorek wapnia	EMS	12340	Utrwalanie pęcherza in situ
Przewodząca taśma z klejem węglowym	Ted Pella	16084-1	Przetwarzanie próbek SEM
Przewodząca srebrna farba	Ted Pella	16034	Przetwarzanie próbek SEM
CPD 300 Krytyczny Punkt Suszarka	Leica		Przetwarzanie próbek SEM
Metalowy klips cytolejka	Simport	M964B	Cytospinowa analiza moczu
Etanol	EMS	15050	Przetwarzanie próbek SEM
Glukoza	Sigma	G7528	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Glutaraldehyd	EMS	16320	Utrwalanie pęcherza in situ
Zestaw do bejcowania Hema 3	Fisher	23123869	Cytospinowa analiza moczu
HEPES	Cellgro	25-060-Cl	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Iridium	Ted Pella	91120	Przetwarzanie próbek SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Skaningowy mikroskop elektronowy
Oczyszczacz wody Milli-Q	Millipore	IQ-7000	Przetwarzanie próbek SEM
Czterotlenek osmu	EMS	19170	Przetwarzanie próbek SEM
Paraformaldehyd	EMS	15710	Utrwalanie pęcherza in situ
Rury polietylenowe	Intramedyk	427401	dla cewników
Proteose Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Dla NYCIII G. vaginalis media wzrostu
Ostrze do brzytwy pokryte podwójną krawędzią PTFE	EMS	72000	Cięcie pęcherzy dla SEM