Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Streszczenie

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest stopniowo rozcieńczana, nakładana na agarze z antybiotykami i inkubowana w celu umożliwienia tworzenia i ilościowania kolonii.

Protokół

1. Przygotowanie i przechowywanie szczepionka M. absceus
   1. Warunki wzrostu ropnia M.
      1. Należy wyprowadzić M . abscessus z zapasu glicerolu o temperaturze -80°C na agar Middlebrook 7H10 zawierający 10% OADC i 0,5% glicerolu (7H10OADc) oraz uzupełnić odpowiednim antybiotykiem w zależności od markera oporności przenoszonego przez wektor kodujący białko fluorescencyjne. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 4-5 dni.
      2. Weź kolonię grzybniczy z pozytywną fluorescencją i zaszczep 1 ml bulionu Middlebrook 7H9 z dodatkiem OADC, 0,2% glicerolu, 0,05% Tween 80 (7H9OADc/T) z wymaganym antybiotykiem w 15 ml sterylnej tubce plastikowej. Inkubuj w 30 °C przez tydzień bez potrząsania.
         UWAGA: Tween 80 ogranicza zlepianie się i gromadzenie bakterii.
      3. Ponownie zawiesz prehodowlę uzyskaną w 2.1.2 w 50 ml Middlebrook 7H9OADc/T w kolbach do hodowli tkanek o pojemności 150 cm2 do końcowej wartości 0,1 OD₆₀₀ (odpowiadającej około 5,107 bakterii/ml) i inkubuj dalej w 30 °C przez 4 dni, aby uzyskać wykładniczo rosnącą hodowlę (OD₆₀₀ = 0,6 do 0,8).
         UWAGA: Aby zminimalizować zgrudkowanie, zwłaszcza w wersji szorstkiej, inkubacja nie powinna przekraczać 5 dni. Zarówno gładkie, jak i surowe warianty wykazują podobne tempo wzrostu.
2. Przygotowanie inokulum M. absceus
   UWAGA: Ze względu na dużą skłonność szorstkego ropnia M. do tworzenia dużych agregatów i produkcji strunow, konieczne jest specjalne leczenie, aby uzyskać jednorodne i ilościowo kontrolowane inokule przed mikrozastrzykami w zarodkach. Ten zabieg stosowany jest także na gładkich bakteriach, które produkują kruszywa, choć w mniejszym stopniu niż szczep szorstki.
   1. Zbieraj wykładniczo rosnące kultury z kolb o powierzchni 150 cm2 przez wirowanie w ilości 4 000 x g przez 15 minut w rurce z tworzywa sztucznego o pojemności 50 ml, a następnie ponownie zawiesij granulat bakteryjny w 1 ml 7H9OADc/T. Zawiera 200 μl zawiesiin bakteryjnych w rurkach mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Praca z małymi objętościami w strzykawkach 1 ml jest konieczna, aby uzyskać wysoce jednorodne zawiesiny.
   2. Homogenizuj zawiesiny bakteryjne igłą 26-G (15 sekwencji w górę i w dół), sonikuj trzy razy przez 10 sekund (z 10-sekundowymi przerwami między każdą sekwencją sonifikacji) za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej. Dodaj 1 ml 7H9OADc/T i krótko przemieszaj wir. Wirówka 3 minuty przy 100 x g.
   3. Ostrożnie zbieraj supernatanty zawierające mykobakterie, aby uniknąć grudek, a jednorodne zawiesiny zgromadzić w 50 ml sterylnej plastikowej tubce.
   4. Sprawdź wizualnie obecność ewentualnych pozostałości agregatów bakteryjnych.
      UWAGA: Jeśli kruszywa nadal są obecne, przejdź do dodatkowego kroku wirowania w 100 x g przez 2 minuty i pobierz supernatant.
   5. Wiruj zawiesinę w stężeniu 4 000 x g przez 5 minut, ponownie zawiesz granulkę w 200 μl 7H9OADc/T i przystąpi do wstrzyknięcia.
   6. Oceń końcowe stężenie bakterii, nakładając seryjne rozcieńczenia (w 1x PBST) na agarze 7H10OADc oraz licząc jednostki tworzące kolonie (CFU) po 4 dniach inkubacji w 30 °C. CFU powinny być ustalane dla każdej nowej partii.
   7. Przygotuj zamrożone zapasy inokula, przechowując 5 μl aliquotów w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Ocena przez CFU dotyczących zamrożenia alikwotów o temperaturze -80°C jest warunkiem wstępnym określenia dokładnej liczby żywotnych bakterii, ponieważ zamrożenie/rozmrażanie może wpływać na żywotność bakterii w inokulum. Te zamrożone inokule są gotowe do kolejnych zastrzyków. Ponieważ wszystkie alikwoty zawierają taką samą liczbę CFU, pozwalają one na powtarzalne wstrzykiwanie bakterii z jednego eksperymentu do drugiego.
3. Kontrola jakości inokulum
   UWAGA: Barwienie Ziehl-Neelsena (specyficzne dla mykobakterii) może być stosowane do porównania jakości zawiesin bakteryjnych przed i po procedurach homogenizacji.
   1. Rozłóż i rozłóż jedną kroplę ujednoliconej zawiesiany bakteryjnej na szklanym szkiełku i pozwól jej całkowicie wyschnąć. Utrwal rozmazywanie przez co najmniej 30 minut na grzewcy ustawionej na 65-70 °C i bejcuj za pomocą protokołu barwienia Ziehl-Neelsen.
   2. Obserwuj rozmaz bakteryjny mikroskopem za pomocą obiektywu 100X i porównaj z rozmazem nieprzetworzonej zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 1).

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego

1. Tarło i zbieranie jaj danio pręgowanego
   1. Dzień przed tarłem rozmnażaj dorosłe danio, umieszczając 2 samce i jedną samicę (zwykle stosunek 2:1 zapewnia optymalną szybkość zapłodnienia) do komory rozrodczej, składającej się z osobnego akwarium z koszykiem na zbieranie jaj.
      UWAGA: Koszyki do zbierania jajek służą do ochrony jaj przed zjedzeniem przez rodziców i ułatwienia zbierania jaj.
   2. Przy 1 hpf pobieraj jaja i tylko odpowiednio rozwinięte zarodki w szalce Petriego o średnicy 100 mm, wypełnionej 25 ml wody z niebieskiej ryby (maksymalnie 100 zarodków na miskę) i utrzymuj je w temperaturze 28,5 °C. Niezapłodnione komórki jajowe są odrzucane.
2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego do zastrzyków
   1. Około 24 godziny po zapłodnieniu (hpf) odchorionuj zarodki cienką pęsetą w szalce Petriego o średnicy 100 mm i utrzymuj je w temperaturze 28,5 °C.
   2. Pobierz zarodki o masie 30-48 hpf pipetą i przenieś je do komory pozycjonującej w kształcie litery "V" wypełnionej 25 ml wody rybnej zawierającej 270 mg/l tricainy. Prawidłowo ułóż zarodki w kanałach, używając domowego narzędzia do mikroładowania (domowej roboty, przyciętej końcówki mikroładowaczowej), zoptymalizowanej pod kątem łatwiejszej mikromanipulacji.
      UWAGA: Do dożylnych zastrzyków do żyły ogonowej należy schylić grzbietową stronę w dół, a grzbietową stronę ku górze przy zastrzykach do mięśni ogona.

3. Procedura mikroiniekcji

UWAGA:. Aby ocenić chronologię zakażenia M. ropniem (przeżycie, obciążenia bakteriami, kinetyka i charakterystyka infekcji), preferuje się zastrzyki do żyły ogonowe zarodków 30 hpf. Aby zobrazować rekrutację komórek odpornościowych, zastrzyki wykonuje się w lokalnych miejscach, takich jak mięśnie ogona zarodka o masie 48 hpf.

1. Rozcieńcz inokulum mykobakterii w 1X PBST (w zależności od liczby CFU), zawierającej 10% czerwonego fenolu, aby sprawdzić prawidłowe wstrzykiwanie.
2. Załaduj igłę do mikrokapilar iniekcyjnych 5-10 μl inokulum bakteryjnego za pomocą końcówki mikroładowającej, podłącz igłę do uchwytu trójwymiarowego mikromanipulatora podłączonego do wtryskiwacza i odłamaj wierzch igły cienką pęsetą, aby uzyskać średnicę otworu 5-10 μm.
3. Skalibruj objętość wtrysku, regulując ciśnienie mikrowtrysku (20-50 hPa) oraz czas (0,2 sekundy).
   UWAGA: Wymagana objętość zastrzyku jest kalibrowana przez wizualne określenie średnicy kropli wypuszczonej do żółtka zarodka.
4. W przypadku zastrzyku do żyły odowo-ogonową ustaw zarodek tak, aby strona brzuszna była skierowana do igły, a końcówka igły zbliżona do otworu moczowo-końcowego, celując w żyłę odonową, delikatnie wpychając czubek igły w zarodek, aż przebije się tylko przez okolicę żyły odonośnej. Dostarczaj pożądaną objętość preparatu bakteryjnego, zwykle 1-3 nl zawierające około 100 CFU/nl.
5. Do zastrzyku domięśniowego ustaw zarodek tak, by grzbietowa strona była zwarta do igły, umieść igłę nad jednym somitem i wstrzyknij niewielką objętość (1 nl) inokulum.
   UWAGA: Jeśli chodzi o zastrzyki do żyły ogonowej, również trudne są do wykonania zastrzyki domięśniowe. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć przeciążenia, które mogłoby uszkodzić otaczające tkanki.
6. Na końcu procedury wstrzyknięcia kontroluj rozmiar inokulum poprzez wstrzyknięcie tej samej objętości zawiesiny bakteryjnej w kropli sterylnego PBST, następnie nakładanie płytek na 7H10OADc i liczenie CFU. Około 100 zarodków można wstrzyknąć igłą.
   UWAGA: Ponieważ szorstki M. absceus mogą nadal tworzyć agregaty w igiełce, zastrzyki muszą być wykonywane bezpośrednio po przygotowaniu inokulum.
7. Przenieś zakażone ryby pojedynczo na płytki z 24 dołkami zawierające 2 ml/studnię wody rybnej i inkubuj w temperaturze 28,5 °C. Zarodki wstrzyknięte 1-3 nl 1X PBS mogą być używane jako kontrola.
8. Prawidłowe zakażenie bakteriami fluorescencyjnymi w embrionach jest monitorowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego

1. Ustalenie na podstawie spisu CFU
   1. W wyznaczonym momencie zbierać grupy zakażonych zarodków (5 na schorzenie) w mikrowirówkach o pojemności 1,5 ml (1 zarodek/rurka), znieczulać zarodki kriogenicznie przez inkubację na lodzie przez 10 minut oraz uśpić za pomocą przedawkowania tricainy (300-500 mg/L)
   2. Przemyj zarodki sterylną wodą dwukrotnie i wydaj je w nowej tubce. Każdy zarodek należy lizować 2% Triton X-100 rozcieńczonym w 1X PBST za pomocą igły 26-G i homogenizować zawiesinę aż do zakończenia lizy. Wirówka zawieszenia i ponowna zawieszka w 1X PBST z 0,05% Tween 80. Seryjne rozcieńczenia homogenatów są nakładane na Middlebrook 7H10OADc i uzupełniane BBL MGIT PANTA, zgodnie z zaleceniami dostawcy.
      UWAGA: M. abscessus jest bardziej podatny na leczenie NaOH niż M. marinum. Dekontaminacja lizatów ryb bez wpływu na wzrost ropnia M. może być skutecznie przeprowadzona za pomocą koktajlu antybiotykowego BBL MGIT PANTA.
   3. Inkubuj płytki przez 4 dni w temperaturze 30 °C i licz kolonie.

Wyniki

Rysunek 1. Przygotowanie rozproszonych szczepień M. absceus. Barwienie Ziehl-Neelsen wariantów R lub S uprawianych na podłożu bulionowym przed jakimkolwiek zabiegiem (górne panele) lub po zabiegu (dolne panele) ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BBL MGIT PANTA	BD Biosciences	245114
Albumina surowicy bydlęcej	Euromedex	04-100-811-E
Katalaza z wątroby bydła	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD Biosciences	262710
Difco Middlebrook 7H9 Bulion	BD Biosciences	271310
Sól metanonsulfonianowa etylo3-aminobenzoanu (tricaina)	Sigma-Aldrich	A5040
Kwas oleinowy	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldehyd	Delta mikroskopia	15710
Phenol Red	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Agaroza niskotopniejąca	Sigma-Aldrich
Natychmiastowe morskie sole morskie	Aquarium Systems Inc
Naczynia włosowate szkła borosilikatowego	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm O.D. x 0,78 mm I.D.
Urządzenie do wyciągania mikropipety	Sutter Instrument Inc		Płonący/brązowy mikropipeta wyciągacz p-87
Mikroinjektor	Badania Tritech		Cyfrowy mikroINJECTOR, MINJ-D
Pęseta	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Końcówki mikroładowaczy	Eppendorf