Modelowanie patogenezy aeromonasów u C. elegans za pomocą testu przetrwania

Streszczenie

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test przeżycia z użyciem C. elegans do modelowania patogenezy Aeromonas , gdzie doustne spożycie bakterii prowadzi do infekcji i śmiertelności jelit, umożliwiając ilościową ocenę zjadliwości bakterii w żywym systemie gospodarza.

Protokół

1. Testy przetrwania C. elegans z Aeromonas

1. W dniu wysiewania robaków L1 na wzbogaconym podłożu wzrostu nicieni ENGM rozsiewanego E. coli OP50, wybierz pojedynczą kolonię każdego z czterech szczepów Aeromonas , czyli E. coli OP50, i hoduj odpowiednio 2 mL bulionu LB w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
   UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, ten krok należy wykonać w laminarnym okapie przepływowym. Wykorzystano tutaj następujące szczepy bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pokarmu C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany, patogenny kliniczny izolat A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 oraz A. caviae A2-9307121 to reprezentatywne izolaty kliniczne z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.
2. Zmierz absorpcję OD₆₀₀ (gęstość optyczna przy 600 nm) bulionu bakteryjnego i dostosuj bulion bakteryjny do OD₆₀₀ = 2,0 z bulionem LB.
3. Na każdej płycie 6 cm NGM (podłoże wzrostu nicieni) rozłóż i rozsmaruj 30 μL bulionu bakteryjnego. Hoduj talerze w temperaturze pokojowej przez noc.
   UWAGA: Aby przygotować NGM, rozpuścić 3 g NaCl (chlorku sodu), 2,5 g bakteryjnego peptonu oraz 20 g agaru w 1 litrze wody dejonizowanej. Autoklawuj w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Poczekaj, aż ostygnie do 55 °C w kąpieli wodnej, a następnie dodaj 1 mL 1 M CaCl₂ (chlorek wapnia), 1 mL 1 M MgSO₄ (siarczan magnezu), 1 ml 5% cholesterolu w etanolu oraz 25 ml buforu fosforanowego. Mieszaj, żeby dobrze wymieszać.
4. W dniu, gdy robaki L1 osiągną poziom L4, losowo wybierz i przenieś 50 robaków na płytkę NGM z każdym z czterech szczepów Aeromonas , czyli E. coli OP50.
5. Inkubuj płytki NGM w temperaturze 20 °C aż do zakończenia testu.
6. Przenieś wszystkie żywe robaki na nowo przygotowaną płytkę NGM z bakteriami i codziennie licz liczbę żywych, martwych i czujnikowych robaków, aż ostatni zginie.
   UWAGA: Codziennie przenosi robaki na świeżo przygotowaną płytkę NGM dla utrzymania infekcji, nawet jeśli używasz bezpłodnych robaków (np. glp-4 lub FudR).
7. Narysuj krzywe przetrwania na podstawie codziennych obliczeń danych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator wstrząsający	YIH DER	LM-570R	Inkubacja bakterii
NaCl	SIGMA	31434	Przygotowanie podłoża hodowlanego
MgSO₄	SIGMA	M7506	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Agar	Difco	214530	Przygotowanie podłoża hodowlanego
CaCl₂	SIGMA	C1016	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Cholesterol	SIGMA	C8503	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Płytka Petriego 6 cm	ALPHA PLUS	46	Przygotowanie płyty agarowej
Pepton bakteryjny	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Przygotowanie podłoża hodowlanego
FudR	SIGMA	1271008	Przygotowanie podłoża hodowlanego
System mikroskopu	Nikon	Odwrócona eklipaza Ti	Obrazowanie mikroskopowe