Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Podsumowanie

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Streszczenie

Biofilmy są społecznościami mikroorganizmów przytwierdzonymi do powierzchni, które można spotkać w środowiskach medycznych, przemysłowych i naturalnych. W rzeczywistości życie w biofilmie prawdopodobnie stanowi dominujący tryb wzrostu mikroorganizmów w większości środowisk. Dojrzałe biofilmy charakteryzują się kilkoma wyraźnymi cechami. Mikroorganizmy w biofilmach są zazwyczaj otoczone macierzą zewnątrzkomórkową, która zapewnia strukturę i ochronę społeczności. Mikroorganizmy rosnące w biofilmie posiadają również charakterystyczną architekturę, zazwyczaj składającą się z makrokolonii (zawierających tysiące komórek) otoczonych wypełnionymi płynem kanałami. Mikroorganizmy wyhodowane w biofilmach są znane z wysokiej odporności na szereg środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym na antybiotyki o znaczeniu klinicznym.

Test w płytkach mikrotitracyjnych jest ważnym narzędziem do badania wczesnych etapów tworzenia się biofilmu; był on stosowany przede wszystkim do badania biofilmów bakteryjnych, choć wykorzystywano go również do badania tworzenia się biofilmów grzybiczych. Ponieważ test ten wykorzystuje statyczne warunki wzrostu okresowego, nie umożliwia on powstania dojrzałych biofilmów, które są typowo kojarzone z systemami przepływowymi. Niemniej jednak, metoda ta okazała się skuteczna w identyfikacji wielu czynników niezbędnych do inicjacji tworzenia biofilmu (np. wici, pili, adhezyn, enzymów zaangażowanych w wiązanie i metabolizm cyclic-di-GMP), a także genów zaangażowanych w produkcję zewnątrzkomórkowych polisacharydów. Co więcej, opublikowane prace wskazują, że biofilmy hodowane w płytkach mikrotitracyjnych wykształcają niektóre właściwości biofilmów dojrzałych, takie jak tolerancja na antybiotyki i oporność na efektory układu odpornościowego.

Ten prosty test w płytce mikrotitracyjnej umożliwia tworzenie się biofilmu na ściankach i/lub dnie płytki. Wysoka przepustowość tego testu sprawia, że jest on użyteczny w badaniach genetycznych, a także w testowaniu tworzenia biofilmu przez wiele szczepów w różnych warunkach wzrostu. Warianty tego testu były stosowane do oceny wczesnego tworzenia biofilmu dla szerokiej gamy drobnoustrojów, w tym między innymi pseudomonad, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria oraz grzybów.

W opisanym tutaj protokole skupimy się na zastosowaniu tego testu do badania tworzenia biofilmu przez organizm modelowy Pseudomonas aeruginosa. W tym badaniu stopień tworzenia biofilmu mierzy się przy użyciu barwnika fioletowego krystalicznego (CV). W literaturze opisano jednak szereg innych barwników kolorymetrycznych i metabolicznych służących do ilościowego oznaczania tworzenia biofilmu w teście z wykorzystaniem płyt mikrotytrujnych. Prostota, niski koszt i elastyczność testu z płytkami mikrotytrujnymi sprawiły, że stał się on kluczowym narzędziem w badaniu biofilmów.

Protokół

1. Hodowla biofilmu

1. Hodować kulturę szczepu dzikiego Pseudomonas aeruginosa lub szczepu mutanty przez noc w pożywce bogatej (np. LB)
2. Rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:100 w świeżej pożywce do analiz biofilmu. Standardową pożywką do analiz biofilmu dla P. aeruginosa jest minimalna pożywka M63 uzupełniona o siarczan magnezu, glukozę i kwasy kasamino (patrz Tabela). Jako alternatywną pożywkę promującą tworzenie biofilmu, która stymuluje mniejszy wzrost planktoniczny i prowadzi do powstania bardziej wytrzymałego biofilmu, glukozę i kwasy kasamino można zastąpić argininą jako jedynym źródłem węgla i energii.
3. Dodać 10 μL rozcieńczenia do każdej studzienki w płytce 96-dołkowej. W przypadku analiz ilościowych zazwyczaj stosujemy 4-8 powtórzeń dla każdej serii badawczej.
4. Inkubować płytkę mikrotitryczną przez 4-24 h w temperaturze 37°C.

2. Barwienie biofilmu

1. Po inkubacji usunąć komórki, odwracając płytkę i wytrzepując ciecz.
2. Delikatnie zanurzyć płytkę w małym pojemniku z wodą (np. wykorzystując dno pudełka z końcówkami do pipety P100 jako pojemnika). Wytrzepać wodę. Powtórzyć ten proces drugi raz. Krok ten pomaga usunąć nieprzytwierdzone komórki oraz składniki pożywki, które mogłyby zostać zabarwione w kolejnym etapie, co znacząco obniża tło barwienia.
3. Do każdej studzienki płytki mikrotitracyjnej dodać 125 μL 0,1% roztworu fioletu krystalicznego w wodzie. Podczas przygotowywania roztworu należy używać rękawic i fartucha laboratoryjnego. Zachować ostrożność podczas odważania fioletu krystalicznego, ponieważ proszek jest higroskopijny i łatwo barwi odzież, skórę itp.
4. Inkubować płytkę mikrotitracyjną w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
5. Przepłukać płytkę 3-4 razy wodą, zanurzając ją w pojemniku z wodą zgodnie z powyższym opisem, a następnie wytrzepać i energicznie osuszyć na stosie ręczników papierowych, aby całkowicie usunąć z płytki nadmiar komórek i barwnika.
6. Odwrócić płytkę mikrotitracyjną dnem do góry i pozostawić do wyschnięcia przez kilka godzin lub przez noc.
7. W przypadku analiz jakościowych można wykonać zdjęcia wyschniętych studzienek.

3. Ilościowe oznaczanie biofilmu

1. Do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej dodać 125 μL 30% kwasu octowego w wodzie w celu rozpuszczenia CV.
2. Inkubować płytkę mikrotitracyjną w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
3. Przenieść 125 μL rozpuszczonego CV do nowej płytki mikrotitracyjnej z płaskim dnem.
4. Zmierzyć absorbancję w czytniku płytek przy 50 nm, stosując 30% kwas octowy w wodzie jako próbę kontrolną (blank).

4. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. przedstawia reprezentacyjny wynik testów tworzenia biofilmu przeprowadzonych dla Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens i Staphylococcus aureus(A) Widok z boku studzienki z biofilmem P. aeruginosa (8 godz., 37°C). (B) Widok z boku studzienki z biofilmem z P. fluorescens (6 godz., 30°C). (C) Widok z góry biofilmu utworzonego przez S. aureus w mikro płytce do miareczkowania o płaskim dnie (dwie studzienki, 24 godz. 37°C). P. aeruginosa i *P. fluorescens* oba organizmy są ruchliwe i tworzą biofilm na granicy fazy powietrze-ciecz. S. aureus jest nieruchomy i tworzy biofilm na dnie studzienki.

Dyskusja

Metodę tę można modyfikować w celu zastosowania u szerokiej gamy gatunków drobnoustrojów. Mikroorganizmy ruchliwe zazwyczaj przylegają do ścianek i/lub dna studzienek, podczas gdy mikroorganizmy nieruchliwe zazwyczaj przylegają tylko do dna studzienek. Optymalne warunki tworzenia biofilmu (tj. pożywka wzrostowa, temperatura, czas inkubacji) muszą zostać określone empirycznie dla każdego drobnoustroju. Zaleca się wykonanie wielu powtórzeń (4-8) dla każdego szczepu lub warunku oraz uwzględnienie kontroli pozytywnej, a jeśl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 X M63			Przygotować roztwór stokowy 5X M63, rozpuszczając 15 g KH2PO4, 35 g K2HPO4 oraz 10 g (NH4)2SO4 w 1 L wody. Ten roztwór zapasowy d–Nie wymaga autoklawowania i może być przechowywane w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć roztwór stokowy 5X w stosunku 1:5, autoklawować, schłodzić, a następnie dodać wymagane składniki.
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
Siarczan magnezu	Fisher Scientific	M63-500	Dodać do stężenia końcowego 1 mM. Przygotować roztwór zapasowy 1 M w wodzie i wysterylizować w autoklawie.
Glukoza	Fisher Scientific	D16-3	Dodać do stężenia końcowego 0,2%. Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20% w wodzie i wysterylizować w autoklawie.
Aminokwasy kazeinowe	BD Biosciences	223050	Dodać do stężenia końcowego 0,5%. Przygotować roztwór stokowy o stężeniu 20% w wodzie i wysterylizować w autoklawie.
Arginina	Sigma-Aldrich	A5131	Dodać do stężenia końcowego 0,4%. Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 20% w wodzie i wysterylizować poprzez filtrację. To alternatywne źródło węgla/energii może zastąpić glukozę i kwasy kasamino.
Płytki mikrotitracyjne	BD Biosciences	353911	Falcon 3911, Microtest III, elastyczne płytki do analiz, 96 dołków, dno w kształcie litery U, nisterylne, bez modyfikacji powierzchniowej dla hodowli tkankowej.
Przykrywki do płytek mikrotitracyjnych	BD Biosciences	353913	Przykrywki można wykorzystać ponownie po oczyszczeniu ich 95% etanolowym roztworem w wodzie.
Fiolet krystaliczny	Sigma-Aldrich	229641000	Przygotować jako 0,1% roztwór w wodzie.