Ocena zjadliwości bakteryjnej za pomocą testu toksyczności płynnej C. elegans

Abstract

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje test toksyczności cieczy C. elegans z użyciem Aeromonas, metodę służącą do oceny zjadliwości bakterii poprzez pomiar przeżywalności robaków w środowisku ciekłym o ograniczonym zawartości składników odżywczych. Test wykazuje patogenność specyficzną dla szczepu na podstawie zakresu uszkodzeń i śmiertelności wywołanej toksynami u C. elegans.

Protocol

1. Badanie toksyczności cieczy C. elegans z Aeromonas

UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy wykonywać kroki w laminarnym okapie przepływowym.

1. Dzień po wysiewaniu robaków L1 na płytce ENGM (wzbogacone nematode growth medium) rozsmaruj E. coli OP50, wybierz po jednej kolonii każdego z czterech szczepów Aeromonas i E. coli OP50, a następnie hoduj z wywarem po 5 mL LB w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
   UWAGA: W protokole zastosowano następujące szczepy bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pokarmu C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany, patogenny kliniczny izolat A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 oraz A. caviae A2-9307121 to reprezentatywne kliniczne izolaty z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.  
   UWAGA: Aby przygotować wzbogacony NGM (ENGM), rozpuścić 3 g NaCl, 5 g peptonu bakteryjnego, 1 g ekstraktu drożdżowego oraz 30 g agaru w 1 L wody dejonizowanej. Autoklawuj w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Poczekaj, aż ostygnie do 55 °C w kąpieli wodnej, dodaj 1 mL 1 M CaCl₂, 1 mL 1 M MgSO₄, 1 ml 5% cholesterolu w etanolu oraz 25 mL buforu fosforanowego. Mieszaj, żeby dobrze wymieszać.
2. Zmierz absorpcję OD₆₀₀ bulionu bakteryjnego.
3. Wiruj bulion bakteryjny w ilości 3 500 x g przez 15 minut, aby usunąć bulion LB. Ponownie zawiesij bakterie i dostosuj bulion bakteryjny do OD₆₀₀ = 3,0 z S medium. Dodaj 195 μL bulionu bakteryjnego w medium S do co najmniej 8 dołków na płytce z 96 dołkami.
   UWAGA: Skład medium S: Aby przygotować podłoże S, należy wymieszać 40 mL S bazalnego, 0,4 mL 1 M cytrynianu potasu, 0,4 mL roztworu metali śladowych, 0,12 mL 1 M CaCl₂, 0,12 mL 1 M MgSO₄, 40 μL 5% cholesterolu w etanolu oraz 1 mL 8 mM FudR przed użyciem.
4. Zmyj robaki L4 na płytce ENGM E. coli OP5 używając medium M9. Dostosuj roztwór robaka do stężenia 5 robaków na μL i dodaj 5 μL roztworu robaka do każdej dołki na płytce 96-dołowej. Upewnij się, że w każdej studni jest około 25 robaków.
5. Inkubuj płytę z 96 dołkami na shakerze przy 200 obr./min i 25 °C.
6. Policz żywe i martwe robaki po 24, 48 i 72 godzinach. Oblicz wskaźniki przeżycia każdej studni według następującego wzoru: (Żywe robaki/Łączna liczba robaków) × 100%.
7. Narysuj wykres rozrzutowy z codziennymi obliczeniami danych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inkubator wstrząsający	YIH DER	LM-570R	Inkubacja bakterii
NaCl	SIGMA	31434	Przygotowanie podłoża hodowlanego
MgSO₄	SIGMA	M7506	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Agar	Difco	214530	Przygotowanie podłoża hodowlanego
CaCl₂	SIGMA	C1016	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Cholesterol	SIGMA	C8503	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Etanol	SIGMA	32205	Przygotowanie podłoża hodowlanego
KOH	SIGMA	P5958	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Płytka Petriego 6 cm	ALPHA PLUS	46	Przygotowanie płyty agarowej
Płyta z 96 dołami	FALCON	353072	Badanie płynne
Pepton bakteryjny	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Ekstrakt drożdżowy	SIGMA	92144	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Kwas cytrynowy•H₂O	SIGMA	Ok. 1909	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Tri-cytrynian potasu•H₂O	SIGMA	104956	Przygotowanie podłoża hodowlanego
FudR	SIGMA	1271008	Przygotowanie podłoża hodowlanego
EDTA z dissodem	SIGMA	E1644	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Trypton	SIGMA	16922	Przygotowanie podłoża hodowlanego
System mikroskopu	Nikon	Odwrócona eklipaza Ti	Obrazowanie mikroskopowe
Naukowa kamera CCD	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Obrazowanie mikroskopowe