Badanie martwicy mięśni u C. elegans wywołane przez patogenny szczep aeromonas

Streszczenie

Źródło: Chen, Y. i in., Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje test martwicy mięśni u C. elegans (Caenorhabditis elegans) z użyciem patogennych szczepów Aeromonas . Poprzez karmienie zielonych białek fluorescencyjnych (GFP) na płytkach z nasionami Aeromonas, test modeluje infekcję bakteryjną i ujawnia uszkodzenia tkanek za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Postępująca utrata struktury mięśniowej i sygnału GFP wskazuje na odpowiedź martwiczą wywołaną przez Aeromonas.

Protokół

1. Badanie martwicy mięśni Caenorhabditis elegans z Aeromonas

UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, te kroki należy wykonać w laminarnym okapie przepływowym.

1. W dniu zasiewania robaków L1 na wzbogaconym podłożu wzrostu nicieni (ENGM) rozsiewanym Escherichia coli OP50, wybierz po jednej kolonii każdego z czterech szczepów Aeromonas oraz E. coli OP50 i hoduj po 2 ml bulionu Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. UWAGA: Tutaj użyto następujących szczepów bakterii: E. coli OP50, normalne źródło pokarmu C. elegans. A. dhakensis AAK1, pierwszy w pełni zsekwencjonowany, patogenny kliniczny izolat A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 oraz A. caviae A2-9307121 to reprezentatywne izolaty kliniczne z Narodowego Szpitala Uniwersyteckiego Cheng Kung.
2. Zmierz absorpcję OD₆₀₀ bulionu bakteryjnego i dostosuj bulion bakteryjny do OD₆₀₀ = 2,0 z bulionem LB. Rozłóż i rozłóż 30 μL bulionu bakteryjnego na płytkach 6 cm pożywki wzrostu nicieni (NGM). Hoduj talerze w temperaturze pokojowej przez noc.
3. W dniu, gdy robaki L1 osiągną poziom L4, przenieś 50 robaków na każdą płytkę NGM z każdym z czterech szczepów Aeromonas , czyli E. coli OP50. Inkubuj płytki NGM w temperaturze 20 °C. Przenosi robaki co 24 godziny na nowo przygotowane płytki NGM z bakteriami.
4. Zrób zdjęcia mięśni mikroskopem fluorescencyjnym.
   1. Losowo wybierz 10 robaków na żelu agarozowym o stężeniu 2% w M9 medium na ślizgu. Sparaliżuj robaki za pomocą 2 μL 1% azydu sodu w podłożu M9 na agarozie na mniej niż 5 minut przed wykonaniem zdjęć.
   2. Załóż slip i rejestruj obrazy mięśni za pomocą zielonego filtra fluorescencyjnego białka (GFP) na mikroskopie fluorescencyjnym z aparatem sprzężonym ładowaniem. Zrób zdjęcia mięśni na 24, 48 i 72 godzinach po etapie L4.

Przeprowadz analizę obrazów i przygotowanie postaci za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów.
UWAGA: Definicje wyników i poziomów uszkodzenia mięśni przedstawiono na Rysunku 1, dla którego kryteria są wymienione następująco: 3 punkty za brakujące włókna mięśniowe; 2 punkty za pęknięte lub pęknięte włókna mięśniowe; 1 punkt za zgięte włókna mięśniowe; 0 punktów za zdrowe włókna mięśniowe.

Wyniki

Rysunek 1: Odpowiadające wyniki martwicy mięśni u C. elegans wywołanej infekcją Aeromonas. Kryteria martwicy mięśni i odpowiadających im wyników są następujące: 3 punkty ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator wstrząsający	YIH DER	LM-570R	Inkubacja bakterii
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Przygotowanie podłoża hodowlanego
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Przygotowanie podłoża hodowlanego
NaCl	SIGMA	31434	Przygotowanie podłoża hodowlanego
MgSO₄	SIGMA	M7506	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Agar	Difco	214530	Przygotowanie podłoża hodowlanego
CaCl₂	SIGMA	C1016	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Cholesterol	SIGMA	C8503	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Etanol	SIGMA	32205	Przygotowanie podłoża hodowlanego
KOH	SIGMA	P5958	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Płytka Petriego 6 cm	ALPHA PLUS	46	Przygotowanie płyty agarowej
Pepton bakteryjny	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Ekstrakt drożdżowy	SIGMA	92144	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Kwas cytrynowy•H₂O	SIGMA	Ok. 1909	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Tri-cytrynian potasu•H₂O	SIGMA	104956	Przygotowanie podłoża hodowlanego
FudR	SIGMA	1271008	Przygotowanie podłoża hodowlanego
EDTA z dissodem	SIGMA	E1644	Przygotowanie podłoża hodowlanego
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Przygotowanie podłoża hodowlanego
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Przygotowanie podłoża hodowlanego
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Przygotowanie podłoża hodowlanego
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Przygotowanie podłoża hodowlanego
Trypton	SIGMA	16922	Przygotowanie podłoża hodowlanego
System mikroskopu	Nikon	Odwrócona eklipaza Ti	Obrazowanie mikroskopowe
Naukowa kamera CCD	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Obrazowanie mikroskopowe