Stabilizacja wzorców hydrożelu bakteryjnego za pośrednictwem włókien Curli

Streszczenie

Źródło: Spiesz, E. M. i in., Trójwymiarowe wzorowanie inżynierskich biofilmów z biodrukarką zrób to samodzielnie. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje metodę porównywania wzorców alginanu wydrukowanych w 3D, zawierających szczepy bakterii kontrolne lub genetycznie modyfikowane. Testowe odkształcenie powoduje powstanie włókien curli podczas indukcji, które wzmacniają strukturę hydrożelu alginatu. Po leczeniu roztworem chelatującym wapń pozostaje nienaruszony jedynie wzór testowy, co podkreśla stabilizujący efekt produkcji włókna curli.

Protokół

1. 3D proces drukarski

1. Zainstaluj i otwórz oprogramowanie do druku 3D (Tabela materiałów) na komputerze. Podłącz drukarkę 3D do komputera. Przesuń głowicę drukującą do pozycji wyjściowej, klikając przycisk home dla osi X, Y i Z.
2. Dla każdego wydruku umieść przygotowane podłoże drukarskie na określonym miejscu na stole.
3. Skalibruj wysokość głowicy drukującej na osi Z.
   1. Podnieś głowicę do wysokości 22 mm pod ręczną kontrolą, aby nie uderzyła o krawędź szalki Petriego podczas przesuwania się w pożądaną pozycję. Umieść głowicę drukującą nad płytą i przesuwaj ją w dół, aż końcówka pipety dotknie powierzchni drukującej. Przypisz tę pozycję osi Z jako Z1 (wysokość powierzchni drukującej).
   2. Podnieś głowicę drukującą i przesuń ją poza obszar płyty ręcznie sterując osiami X, Y i Z. Jeśli odległość robocza między głowicą a powierzchnią płyty jest zdefiniowana jako Z2, wprowadź Z1 + Z2 do programu drukującego jako wartość Z podczas drukowania.
4. Zaprogramuj kształt druku według własnozaawansowanej, punkt po punkcie określonej metodzie współrzędnych, zgodnie z pożądaną trajektorią.
   1. Jeśli pożądana trajektoria jest prosta, zdefiniuj tylko punkt początkowy i końcowy. Dodanie dodatkowych punktów na zakrzywionych liniach skutkuje gładszymi krzywiznami. Przesuwaj głowicę ręcznie do każdego punktu kolejno i zapisuj współrzędne tych punktów w kolejności. Wprowadź wszystkie te współrzędne oraz prędkość ruchu głowicy drukowanej dla każdego wydrukowanego segmentu do edytora kodu G.
5. Zarówno przed, jak i po druku, podnieś głowicę drukującą na odległość powyżej krawędzi płyty (20 mm) i wysuń się bezpośrednio poza obszar płyty. Zapisz ten program jako plik G-code i załaduj go bezpośrednio do kolejnych wydruków, jednocześnie ponownie mierząc wysokość osi Z dla każdego nowego podłoża drukarskiego.
   UWAGA: Zobacz Tabelę 1, gdzie można zobaczyć przykład kodu G do drukowania kwadratu.
6. Załaduj zaprogramowany plik G-code. Otwórz edytor kodu G-code w oprogramowaniu i zaprogramuj polecenia do wydrukowania pożądanego kształtu. W każdej linii poleceń pozycja głowicy drukującej może być zmieniona w osiach X, Y i/lub Z. Wprowadź wartość Z podczas wszystkich etapów druku jako Z1 + Z2 (wysokość powierzchni drukującej + odległość robocza).
   UWAGA: Prędkość ruchu jest również regulowana; 9 000 mm/min to odpowiednia wartość dla typowych szybkości drukowania.
7. Załaduj płynny bio-atrament do strzykawki i zamontuj je w pompach strzykawkowych bioprintera 3D.
8. Wydrukuj bio-tusz na podłożu drukarskim, klikając przycisk Drukuj.
9. Podczas drukowania steruj ruchem głowicy całkowicie za pomocą oprogramowania. Ręcznie uruchom pompę strzykawkową, zanim głowica zetknie się z powierzchnią drukującą.
   UWAGA: Koordynacja pompy strzykawkowej i drukarki jest empirycznie określana w zależności od prędkości wyciągania, prędkości, z jaką głowica przesuwa się do pierwszego punktu druku, oraz początkowej pozycji głowicy drukującej. Jeśli początkowa pozycja głowicy drukującej wynosi 20 mm, prędkość 9 000 mm/min i prędkość wyciągania 0,1 mL/h, natychmiast po rozpoczęciu drukowania uruchom pompę strzykawkową. Jeśli prędkość wytłaczania zostanie zmieniona z 0,1 mL/h do 0,3 mL/h, należy poczekać 2−3 s, aby uruchomić pompę strzykawkową po rozpoczęciu druku.
10. Zatrzymaj pompę strzykawkową, gdy głowica drukująca dotrze do ostatniego punktu drukowania. Zatrzymaj pompę strzykawkową zanim głowica drukująca się uniesie na końcu procesu drukowania, w przeciwnym razie nadmiar bio-tuszu spadnie na podłoże drukarskie i obniży rozdzielczość druku.
11. Do budowy struktur 3D kontroluj wszystkie ruchy głowicy drukującej w edytorze G-code. Wpisz wysokość druku pierwszej warstwy. Zwiększ wartość Z w kodzie G o 0,2 milimetra dla drugiej warstwy, aby zwiększyć wysokość druku. Następnie zwiększ wartość Z o 0,1 milimetra przy przejściu na wyższą warstwę. Nie przesuwaj płyty podczas procesu drukowania.
12. Aby zmierzyć szerokość i wysokość wydrukowanego hydrożelu, użyj stalowej linijki umieszczonej pod lub obok próbki.

2. Uprawa i testowanie skuteczności produkcji biofilmu przez E. coli

1. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 3−6 dni, aby umożliwić produkcję składników biofilmu (włókien curli). Zrób zdjęcia płyt za pomocą aparatu lub skanera fluorescencyjnego.
2. Aby rozpuścić matrycę alginanu, należy dodać 20 mL roztworu cytrynianu sodu o wartości 0,5 M (pH = 7 korygowane o NaOH) do podłoża drukarskiego i inkubować przez 2 godziny przy potrząsaniu 30 obr./min w temperaturze pokojowej. Usuń płyn i ponownie naobrazuj płytki, aby porównać je z obrazami płyt przed obróbką cytrynianu.

Tabela 1: Proces programowania i wyjaśnienia kodu G do drukowania kwadratu.

Polecenia G-code	Zadania
G1 Z20 F9000	Podnieś oś Z do wysokości 20 mm z prędkością ruchu 9 000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Przesuń się do punktu początkowego pierwszej linii z prędkością ruchu 9 000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Przesuń się w dół w kierunku Z do właściwej (tutaj Z = 6 mm) odległości druku.
G1 X95 Y105 F300	Punkt końcowy pierwszej linii i punkt początkowy drugiej linii.
G1 X135 Y105	Punkt końcowy drugiej linii i punkt początkowy trzeciej.
G1 X135 Y65	Punkt końcowy trzeciej linii i punkt początkowy czwartej linii.
G1 X95 Y65	Punkt końcowy czwartej linii i punkt początkowy pierwszej linii; tworzy się kwadrat.
G1 Z20 F9000	Podnieś oś Z do wysokości 20 mm z prędkością 9 000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Przesuń się na współrzędną (55, 40) poza zakresem szalki Petriego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB bulionowy proszek	Sigma-Aldrich	L3022
Orbitalny potrząsacz	VWR	89032-092	Model 3500
Szalka Petriego	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Rurki krzemowe	VWR	DENE 3100103/25
Pompa strzykawkowa	ProSense B.V.	NE-300
Alginian sodu	Sigma-Aldrich	W201502
Cytrynian sodu monozasadowy	Sigma-Aldrich	71498
Tlenek sodu	VWR	28244.295